Análisis de proteínas Cap-unión en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas
Summary
Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5′ cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.
Abstract
Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5′ mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5′ mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.
Introduction
Control de la traducción está emergiendo como un paso igualmente importante para la regulación transcripcional de la expresión génica, especialmente durante los períodos de estrés celular 1. Un punto central de control de la traducción está en la etapa limitante de la velocidad de iniciación, donde los primeros pasos de la síntesis de proteínas implican la unión del factor de iniciación eucariota 4E (eIF4E) a la 7-metilguanosina (m 7 GTP) 5 'cap de mRNAs 2 . eIF4E es parte de un complejo trimérico llamado eIF4F que incluye eIF4A, una helicasa de ARN, y eIF4G, una proteína de andamiaje necesario para la contratación de otros factores de traducción y los ribosomas 40S 3. En condiciones fisiológicas normales, la gran mayoría de los ARNm se traducen a través de un mecanismo dependiente de la cubierta, pero en períodos de estrés celular aproximadamente el 10% de los ARNm humanos contiene 5 'UTRs que podrían permitir la traducción independiente de caperuza intiation 1,4. traducción dependiente de la cubierta ha sido históricamente sinónimoous con eIF4F, sin embargo, las variaciones de tensión específica de eIF4F se han convertido en un tema de tendencia 5-8.
Diversos estreses celulares causan actividad de eIF4E a ser reprimida a través del objetivo de mamíferos de la rapamicina complejo 1 (mTORC1). Esta quinasa se deteriora bajo tensión, lo que resulta en el aumento de la actividad de uno de sus objetivos, la proteína de unión a 4E (4E-BP). No fosforilada 4E-BP se une a eIF4E y bloquea su capacidad para interactuar con eIF4G haciendo que la represión de la traducción dependiente de cap-9,10. Curiosamente, un homólogo de eIF4E llamado eIF4E2 (o 4EHP) tiene una afinidad mucho menor para 4E-BP 11, tal vez lo que le permite evadir la represión mediada por el estrés. De hecho, caracterizada inicialmente como un represor de la traducción debido a su falta de interacción con eIF4G 12, eIF4E2 inicia la traducción de centenares de ARNm que contienen elementos de respuesta a la hipoxia de ARN en su 3 'UTR durante el estrés hipóxico 6,13. Esta i activacións logrado a través de interacciones con proteínas motivo 4, y el factor inducible por hipoxia (HIF) 2α eIF4G3, ARN de unión para constituir un complejo eIF4F hipóxica, o eIF4F H 6,13. Como un represor en condiciones normales, eIF4E2 une con GIGYF2 y ZNF598 14. Estos complejos fueron, en parte, identificados a través de 7 m resinas de afinidad GTP vinculados-agarosa. Este método clásico 15 es estándar en el campo de la traducción y los ensayos es mejor y más comúnmente utilizado la técnica para aislar los complejos de unión de capuchón en la tracción y la unión in vitro 16-19. A medida que la maquinaria de traducción dependiente de la cubierta está emergiendo como flexible y adaptable con las piezas de cambio inter 6-8,13, este método es una herramienta poderosa para identificar rápidamente nuevas proteínas de unión con forma de capuchones que intervienen en la respuesta al estrés. Por otra parte, las variaciones en eIF4F podría tener amplias implicaciones como varios sistemas modelo eucariotas parecen usar un homólogo de eIF4E2 de las respuestas de estrés talescomo A. thaliana 20, S. pombe 21, 22 D. melanogaster y C. elegans 23.
La evidencia sugiere que las variaciones en eIF4F no pueden limitarse estrictamente a condiciones de estrés, pero estar implicados en la fisiología normal 24. El suministro de oxígeno a los tejidos en los extremos (capilares) o dentro de los tejidos (medido a través de microelectrodos) varía desde 2 hasta 6% en el cerebro 25, 3-12% en los pulmones 26, 3,5 a 6% en el intestino 27, 4% en el hígado 28, 7-12% en el riñón 29, 4% en el músculo 30, y 6-7% en la médula ósea 31. Las células y las mitocondrias contienen menos de 1,3% de oxígeno 32. Estos valores son mucho más cerca de la hipoxia que el aire ambiente donde las células son cultivadas de forma rutinaria. Esto sugiere que lo que se pensaba anteriormente de procesos celulares como la hipoxia-específicos pueden ser relevantes en un entorno fisiológico. Curiosamente, eIF4F y eIF4F H </sup> participar activamente en la iniciación de la traducción de piscinas o clases de ARNm distintos en varios diferentes líneas celulares humanas expuestas al oxígeno fisiológica o "physioxia" 24. Bajos niveles de oxígeno también impulsa el correcto desarrollo fetal y 33 células por lo general tienen mayores tasas de proliferación, mayor esperanza de vida, menos daño en el ADN y las respuestas al estrés en general menos de 34 physioxia. Por lo tanto, eIF4F H es probablemente un factor clave en la expresión de genes de selección en condiciones fisiológicas.
A continuación, ofrecemos un protocolo para cultivar células en condiciones fijas de oxígeno fisiológicas o en un rango de fluctuación dinámica que es probable que sea más representativo de los microambientes de tejido. Una ventaja de este método es que las células se lisan dentro de la estación de trabajo de la hipoxia. No es a menudo claro cómo se lleva a cabo la transición del cultivo de células hipóxicas a la lisis celular en otros protocolos. Las células se quitan a menudo por primera vez de una pequeña incubadora hipoxia serlisis de proa, pero esta exposición al oxígeno podría afectar a las vías bioquímicas como la respuesta celular al oxígeno es rápida (una o dos min) 35. Ciertas proteínas de unión con forma de capuchones requieren la interacción con una segunda base o pueden hidrolizar el GTP m 7, por lo tanto, algunos interactores cap pueden pasarse por alto en el proceso de purificación. Agarosa ligada a los análogos de tapa enzimáticamente resistentes puede sustituirse en este protocolo. La exploración de la actividad y la composición de eIF4F H y otras variaciones de eIF4F a través del método descrito aquí arrojará luz sobre los genes de expresión intrincados mecanismos que utilizan las células en condiciones fisiológicas o las respuestas al estrés.
Protocol
Representative Results
Discussion
El análisis de proteínas de unión a la tapa-en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas pueden permitir la identificación de nuevos factores de iniciación de traducción regulada de oxígeno. La afinidad de estos factores para la tapa 5 'del mRNA u otras proteínas de tapa asociada se puede medir por la fuerza de su asociación a la m 7 GTP ligada perlas de agarosa. Una advertencia de esta técnica es que mide el potencial de unión de topes de proteínas post-lisis, pero se…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.
Materials
| γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads | Jena Bioscience | AC-1555 | Agarose-linked m7GTP |
| 100 mm culture dish | Corning | 877222 | 10-cm culture dish |
| 150 mm culture dish | Thermofisher | 130183 | 15-cm culture dish |
| AEBSF Hydrochloride | ACROS Organics | A0356829 | AEBSF |
| Agarose Beads | Jena Bioscience | AC-0015 | Agarose bead control |
| Bromophenol Blue | Fisher | BP112-25 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 1210-00S | Used to centrifuge small volumes |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 1495970C | Used in culturing primary cells |
| Defined trypsin inhibitor | Fisher | R007100 | DTI |
| Dithiothreital | Fisher | BP172-25 | DTT |
| Epithelial cell medium (complete kit) | ScienCell | 4101 | Includes serum and growth factor supplements) |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 mL | Jena Bioscience | 272076-0251M | GTP |
| HCT116 colorectal carcinoma | ATCC | CCL-247 | Human cancer cell line |
| Human renal proximal tubular epithelial cells | ATCC | PCS-400-010 | HRPTEC |
| Hyclone DMEM/High Glucose | GE Life Sciences | SH30022.01 | Standard media for human cell culture |
| Hyclone Penicillin-Streptomycin solution | GE Life Sciences | SV30010 | Antibiotic component of DMEM |
| H35 HypOxystation | Hypoxygen | N/A | Hypoxia workstation |
| Igepal CA-630 | MP Biomedicals | 2198596 | Detergent component of lysis buffer |
| Monopotassium phosphate | Fisher | P288-500 | KH2PO4 |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | KCl |
| Magnesium chloride | Fisher | M33-500 | MgCl2 |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-10 | NaCl |
| Sodium fluoride | Fisher | 5299-100 | NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer) |
| Disodium phosphate | Fisher | 5369-500 | Na2HPO4 |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | FBS |
| Protease Inhibitor Cocktail (100 x) | Cell Signalling | 58715 | Component of lysis buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | SDS |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 56508 | Na3VO4 |
| Tris Base | Fisher | BP152-5 | Component of buffers |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 2500-067 | Trypsin used to detach adherent cells |
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