Este artigo de vídeo detalha uma simples em metodologia in vivo que pode ser utilizado para caracterizar de forma eficiente e sistematicamente componentes de vias de sinalização complexas e redes reguladoras em muitos embriões de invertebrados.
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Artigo de método
O Poder da Simplicidade: Sea Urchin embriões
Neste artigo
Resumo
Resumo
Notavelmente, poucas vias de transdução de sinal célula a célula são necessárias durante o desenvolvimento embrionário para gerar a grande variedade de tipos de células e tecidos na forma do corpo adulto. No entanto, a cada ano, mais componentes de vias de sinalização individuais são descobertos, e estudos indicam que, dependendo do contexto, há uma conversa cruzada significativa entre a maioria dessas vias. Essa complexidade torna o estudo da sinalização célula a célula em qualquer sistema de modelo de desenvolvimento in vivo uma tarefa difícil. Além disso, análises funcionais eficientes são necessárias para caracterizar moléculas associadas a vias de sinalização identificadas a partir dos grandes conjuntos de dados gerados por telas diferenciais de próxima geração. Aqui, ilustramos um método simples para identificar com eficiência os componentes das vias de transdução de sinal que governam o destino celular e a especificação do eixo em embriões de ouriço-do-mar. A simplicidade genômica e morfológica de embriões semelhantes aos do ouriço-do-mar os torna poderosos modelos de desenvolvimento in vivo para a compreensão de interações complexas de sinalização. A metodologia descrita aqui pode ser usada como um modelo para identificar novas moléculas de transdução de sinal em vias individuais, bem como as interações entre as moléculas nas várias vias em muitos outros organismos.
Introdução
redes de genes reguladores (GRNs) e vias de transdução de sinal estabelecer a expressão espacial e temporal dos genes durante o desenvolvimento embrionário que são usados para construir o plano de adulto corpo do animal. Célula-a-célula vias de transdução de sinal são componentes essenciais destas redes reguladoras, que proporciona os meios pelos quais as células comunicam. Estas interacções celulares estabelecer e aperfeiçoar a expressão de genes reguladores e diferenciação dentro e entre os vários territórios durante a embriogênese 1, 2. Interações entre os moduladores secretadas extracelulares (ligantes,....
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Protocolo
1. Rendimento Morpholino Estratégia de alto design
- Identificar um gene (s) de interesse (por exemplo, abordagem do gene candidato, análise de cis-regulatórias, RNA-Seq e ou telas diferenciais / proteômica).
- Use genômica, transcriptomic, e dados de expressão de genes disponíveis em sites atualizados com freqüência (por exemplo SpBase http://www.echinobase.org 20 e S. purpuratus Genome Pesquisa http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) para determinar se o perfil de expressão espaço-temporal sobrepõe-se com o mecanismo de desenvolvimento em questão. Se não houver dados disponíveis expressão ....
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Resultados
No embrião ouriço-do-mar temos demonstrado que 3 diferentes sinalização Wnt ramos (Wnt / β-catenina, Wnt / JNK, e Wnt / PKC) 4, 25 interagem de modo a formar uma rede de sinalização de Wnt que governa ântero-posterior padronização (AP). Uma das consequências mais importantes destes eventos de sinalização é que a GRN inicial amplamente expressa neuroectoderma anterior (ANE) torna-se restrita a um pequeno território ao redor do pól.......
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Discussão
A metodologia aqui apresentada é um exemplo que ilustra o poder de usar embriões com menos complexidade genômica e morfológica de vertebrados para compreender as vias de transdução de sinalização e GRNs regem mecanismos de desenvolvimento fundamentais .. Muitos laboratórios estão usando ensaios semelhantes durante o desenvolvimento do ouriço-do-mar cedo para dissecar o vias envolvidas em outros eventos de especificação destino de sinalização celular (por exemplo, Notch, Hedgehog, TGF-β, e FGF sinalização)
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Robert Angerer por sua cuidadosa leitura e edição do manuscrito. O NIH R15HD088272-01, bem como o Escritório de Pesquisa e Desenvolvimento e o Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Estadual do Mississippi, forneceram apoio para este projeto ao RCR.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Morfolino bloqueador translacional e/ou morfolino bloqueador de emenda | Gene Tools LLC | Personalizado Mais | informações em www.gene-tools.com |
| Glicerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| FITC (isotiocianato de fluoresceína dextrano) | Invitrogen, Life Technologies | D1821 | Faça 25 mg/mL solução estoque |
| Paraformaldeído 16% solução EM | Grade Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| MOPS | Sigma Aldrich | M1254-250G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 23336-0010 | |
| Formamida | Sigma Aldrich | 47671-1L-F | |
| Levedura tRNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| Soro de Cabra Normal | Sigma Aldrich | G9023-10mL | |
| Anticorpo anti-digoxigenina conjugado com fosfatase alcalina | Roche | 11 093 274 910 | |
| Cloridrato de tetramisol (levamisol) | Sigma Aldrich | L9756-5G | |
| Base Tris UltraPure | Research Products Internationall Corp | 56-40-6 | |
| Cloreto de sódio | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Cloreto de magnésio | Sigma Aldrich | 7786-30-3 | |
| BCIP (5-Bromo-4-Cloro-3-indolil-fosfato | Roche | 11 383 221 001 | |
| 4 Nitro cloreto de tetrazólio azul (NBT) | Roche | 11 383 213 001 | |
| Dimetil Formamida | Sigma Aldrich | D4551-500mL | |
| Cloreto de potássio | Sigma Aldrich | P9541-5KG | |
| Bicarbonato de sódio | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Sulfato de Magnésio | Sigma Aldrich | M7506-2KG | |
| Cloreto de Cálcio | Sigma Aldrich | C1016-500G |
Referências
- Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
- Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (201....
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Reimpressões e permissões
