सादगी की शक्ति: के रूप में समुद्री साही भ्रूण<em> Vivo</em> जटिल सेल करने वाली कोशिका संकेतन नेटवर्क अध्ययन बातचीत के लिए विकास मॉडल

Summary

इस वीडियो लेख विवो पद्धति है कि व्यवस्थित ढंग से और कुशलता से कई अकशेरुकी भ्रूण में जटिल संकेत दे रास्ते और विनियामक नेटवर्क के घटकों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में एक सीधा विवरण।

Abstract

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

Introduction

जीन विनियामक नेटवर्क (GRNs) और संकेत पारगमन मार्ग भ्रूण विकास के दौरान जीन है कि वयस्क जानवर के शरीर योजना का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं के स्थानिक और लौकिक अभिव्यक्ति की स्थापना। सेल के लिए सेल संकेत पारगमन मार्ग इन विनियामक नेटवर्क का अनिवार्य घटक है, इसका मतलब है जिसके द्वारा कोशिकाओं संवाद प्रदान कर रहे हैं। ये सेलुलर बातचीत की स्थापना और embryogenesis ^{1, 2} के दौरान में और बीच में विभिन्न प्रदेशों विनियामक और भेदभाव जीनों की अभिव्यक्ति को परिष्कृत करें। स्रावित बाह्य modulators (ligands, विरोधी), रिसेप्टर्स, और सह रिसेप्टर्स के बीच बातचीत संकेत पारगमन मार्ग की गतिविधियों को नियंत्रित करते हैं। intracellular अणुओं के एक वर्गीकरण इन सूचनाओं बदल जीन अभिव्यक्ति, विभाजन, और / या आकार एक सेल का है, जिसके परिणामस्वरूप पारगमन। जबकि प्रमुख रास्ते में बाह्य और intracellular स्तर पर उपयोग में कुंजी अणुओं के कई हैंजाना जाता है, यह अलग-अलग संकेत दे रास्ते की जटिलता के बड़े हिस्से में कारण एक अधूरा ज्ञान है। इसके अलावा, विभिन्न संकेत दे रास्ते अक्सर एक दूसरे के साथ या तो सकारात्मक या नकारात्मक बाह्य, intracellular पर ट्रांसक्रिप्शनल स्तर ^{3, 4, 5, 6} बातचीत, और। महत्वपूर्ण बात है, संकेत पारगमन मार्ग के मुख्य घटक अत्यधिक सभी metazoan प्रजातियों में संरक्षित कर रहे हैं, और, उल्लेखनीय है, प्रमुख संकेत दे रास्ते के सबसे अक्सर इसी तरह के विकास कार्यों के कई प्रजातियों में प्रदर्शन जब विशेष रूप से निकट से संबंधित संघों से जीवों की तुलना ^{7, 8, 9, 10, 11।}

विकास के दौरान संकेत के अध्ययन के किसी भी जीव में एक चुनौतीपूर्ण काम है, और वहाँ1) रीढ़ में वहाँ संभव ligand और रिसेप्टर / सह न्यूनाधिक बातचीत की बड़ी संख्या, intracellular पारगमन के अणुओं के साथ-साथ हैं: सबसे deuterostome मॉडल (रीढ़, अकशेरुकी Chordates, हेमीकॉर्डेट, और echinoderms) में संकेत दे रास्ते का अध्ययन करने के लिए कई महत्वपूर्ण चुनौतियां हैं जीनोम ^{12, 13, 14} की जटिलता के कारण अलग अलग संकेत दे रास्ते के बीच संभावित बातचीत; 2) जटिल आकृति विज्ञान और रीढ़ में morphogenetic आंदोलनों अक्सर इसे और अधिक मुश्किल में है और संकेत पारगमन मार्ग के बीच कार्यात्मक बातचीत व्याख्या करने के लिए बनाने के लिए; 3) सबसे गैर echinoderm अकशेरुकी deuterostome मॉडल प्रजातियों में विश्लेषण कुछ कंचुकित प्रजातियों ^{15, 16} के अपवाद के साथ gravidity की छोटी खिड़कियों के द्वारा सीमित हैं।

समुद्री साही भ्रूण उपर्युक्त सीमाओं के कुछ है और इन विवो में संकेत पारगमन मार्ग का एक विस्तृत विश्लेषण के प्रदर्शन के लिए कई अद्वितीय गुण प्रदान करता है। इनमें निम्नलिखित शामिल हैं: 1) समुद्री साही जीनोम के रिश्तेदार सादगी काफी संभव ligand, रिसेप्टर / सह रिसेप्टर और intracellular पारगमन अणु की संख्या कम कर ¹⁷ बातचीत; 2) विशिष्टता और रोगाणु परतों और प्रमुख भ्रूण कुल्हाड़ियों की patterning को नियंत्रित करने GRNs अच्छी तरह से समुद्री साही भ्रूण में स्थापित कर रहे हैं, सेल / क्षेत्र के नियामक संदर्भ को समझने में सहायता संकेतों ^{18, 19} प्राप्त; 3) कई संकेत पारगमन मार्ग जल्दी दरार और गेसट्रुला चरणों के बीच अध्ययन किया जा सकता है जब भ्रूण एक भी स्तरित उपकला जिनकी आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए आसान है से मिलकर बनता है; 4) अणुओं शामिलसमुद्र अर्चिन आसानी से छेड़छाड़ कर रहे हैं में रास्ते के संकेत में घ; 5) कई समुद्र अर्चिन एक साल (जैसे स्ट्रोंगिलोसेंट्रोटस purpuratus और Lytechinus variegatus 10 से 11 महीने) के लिए सगर्भा रहे हैं।

यहाँ, हम एक विधि व्यवस्थित ढंग से और कुशलता से संकेत दे रास्ते कि निर्दिष्ट और समुद्री साही भ्रूण में पैटर्न प्रदेशों लाभ है कि कई अकशेरुकी मॉडल प्रणाली जटिल आणविक तंत्र के अध्ययन में प्रस्ताव को वर्णन करने के घटकों को चिह्नित करने के लिए उपस्थित थे।

Protocol

1. उच्च Throughput morpholino डिजाइन की रणनीति ब्याज की एक जीन (एस) (उदाहरण के उम्मीदवार जीन दृष्टिकोण, सीआईएस नियामक विश्लेषण, RNAseq और / या प्रोटिओमिक अंतर स्क्रीन) को पहचानें। अक्सर अद्यतन वेबसाइटों पर जीनो?…

Representative Results

समुद्री साही भ्रूण में हम पता चला है कि 3 अलग WNT सिगनल शाखाओं (Wnt / β-catenin, wnt / JNK, और Wnt / पीकेसी) 4, 25 बातचीत एक WNT सिगनल नेटवर्क है कि नियंत्रित पूर्वकाल पीछे (एपी) patterning के रूप में। इन स…

Discussion

यहाँ प्रस्तुत पद्धति एक उदाहरण है कि रीढ़ की तुलना में कम जीनोमिक और रूपात्मक जटिलता के साथ भ्रूण का उपयोग सिगनल पारगमन मार्ग और GRNs मौलिक विकास तंत्र गवर्निंग समझने के लिए की शक्ति को दिखाता है .. कई प्र?…

Materials

Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino	Gene Tools LLC	Customized	More information at www.gene-tools.com
Glycerol	Invitrogen	15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)	Invitrogen, Life Technologies	D1821	Make 25mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
MOPS	Sigma Aldrich	M1254-250G
Tween-20	Sigma Aldrich	23336-0010
Formamide	Sigma Aldrich	47671-1L-F
Yeast tRNA	Invitrogen	15401-029
Normal Goat Serum	Sigma Aldrich	G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody	Roche	11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole)	Sigma Aldrich	L9756-5G
Tris Base UltraPure	Research Products Internationall Corp	56-40-6
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate	Roche	11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)	Roche	11 383 213 001
Dimethyl Formamide	Sigma Aldrich	D4551-500mL
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541-5KG
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761-500G
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	M7506-2KG
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016-500G