The Power of Simplicity: Sea Urchin embryo som<em> I Vivo</em> Utviklings modeller for å studere Complex Cell-til-celle signaleringsnett Interactions

Summary

Denne videoen artikkelen detaljer en grei in vivo metodikk som kan brukes til systematisk og effektivt karakter komponenter i komplekse signalveier og regulatoriske nettverk i mange virvelløse embryoer.

Abstract

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

Introduction

Gennettverk (GRNs) og signaltransduksjonsveiene etablere den romlige og tidsmessige ekspresjon av genene under embryonal utvikling som brukes til å bygge opp den voksne dyrekroppen plan. Celle-til-celle signaltransduksjonsveier er viktige komponenter i disse regulatoriske nettverk, noe som gir et middel som celler kommuniserer. Disse cellulære interaksjoner etablere og videreutvikle et uttrykk for regulatoriske og differensiering gener i og mellom de ulike områdene under embryogenese ^{1, 2.} Interaksjoner mellom utskilte ekstracellulære modulatorer (ligander, antagonister), reseptorer, og co-reseptorer kontrollere aktiviteter signaltransduksjonsveiene. Et utvalg av intracellulære molekyler transduces disse inngangene resulterer i forandret genekspresjon, divisjon, og / eller formen av en celle. Mens mange av de viktigste molekylene som brukes på ekstracellulære og intracellulære nivåer i de store banene erkjent, er det en ufullstendig kjennskap skyldes i stor grad til kompleksiteten av de enkelte signalveier. I tillegg er forskjellige signalbaner ofte kommuniserer med hverandre enten positivt eller negativt i det ekstracellulære, intracellulære, og transkripsjonelle nivå ^{3, 4, 5, 6.} Viktigere er de viktigste komponentene i signaloverføringsveier høyt konservert i alle metazo arter, og bemerkelsesverdig, de fleste av de store signalveier ofte utføre lignende utviklingsfunksjoner i mange arter når man sammenligner organismer fra nært beslektet phyla spesielt ^{7, 8, 9, 10, 11.}

Studiet av signale under utvikling er en krevende oppgave i enhver organisme, og deter flere store utfordringer til å studere signalveier i de fleste deuterostomier modeller (virveldyr, virvelløse chordatar, hemichordater og pigghuder): 1) I virveldyr er det et stort antall mulige ligand og reseptor / co-modulator interaksjoner, intracellulære transduksjon molekyler, samt potensielle interaksjoner mellom forskjellige signalveier på grunn av kompleksiteten av genomet ^{12, 13, 14;} 2) Et kompleks morfologi og morfogenetiske bevegelser hos virveldyr ofte gjøre det vanskeligere å tolke funksjonelle interaksjoner i og mellom signaloverføringsreaksjonsveier; 3) Analyser i de fleste ikke-echinoderm virvelløse deuterostomier modell arter er begrenset av korte vinduer av graviditet med unntak av noen kappe arter ^{15, 16.}

Dekråkeboller embryo har noen av de ovenfor nevnte begrensninger, og byr på mange unike egenskaper for å utføre en detaljert analyse av signaltransduksjonsveier in vivo. Disse inkluderer følgende: 1) Den relative enkelhet av kråkeboller genomet reduserer antall mulige ligand, reseptor / co-reseptor og intracellulær transduksjon molekyl betydelig interaksjoner ^17; 2) De GRNs kontrollere spesifikasjonen og fordelingen av kjønns lag og store embryonale akser er godt etablert i kråkebolle embryoer, hjelpe i forståelsen av regelverket sammenheng med celle / territorium mottar signalene ^{18, 19;} 3) mange signaltransduksjonsveiene kan studeres mellom tidlige spaltningsseter og gastrula stadier når embryoer bestå av et enkelt lag epitelet hvis morfologi er lettere å analysere; 4) Molekylene involvered i signalveier i kråkebollene er lett manipulert; 5) Mange kråkeboller er gravid i 10 til 11 måneder i året (f.eks Strongylocentrotus purpuratus og Lytechinus variegatus).

Her presenterer vi en metode for å systematisk og effektivt karakter komponenter av signalveier som spesifiserer og mønster territorier i kråkebolle embryo for å illustrere fordelene at flere virvelløse modellsystemer tilbyr i studiet av komplekse molekylære mekanismer.

Protocol

1. Høy gjennomstrømning Morpholino Design Strategy Identifisere et gen (er) av interesse (f.eks kandidat genet tilnærming, cis-regulatoriske analyse, RNAseq og / eller proteomikk differensial skjermer). Bruk genomisk, transcriptomic, og genekspresjon data tilgjengelig på hyppig oppdaterte nettsider (f.eks SpBase http://www.echinobase.org 20 og S. purpuratus Genome Søk http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index html) for å fastslå at spatiotemp…

Representative Results

I kråkebolle embryo har vi vist at 3 forskjellige Wnt signale grener (Wnt / β-catenin, Wnt / JNK, og Wnt / PKC) 4, 25 samhandle for å danne en Wnt signalnettverk som styrer anterior-posterior (AP) mønster. En av de viktigste konsekvensene av disse signal hendelsene er at den første bredt uttrykt anterior neuroectoderm (ANE) grn blir begrenset til et lite område rundt fremre stang ved begynnelsen av gastrulation (24 HPF i <e…

Discussion

Metodikken som presenteres her er et eksempel som illustrerer kraften i å bruke embryo med mindre genomisk og morfologisk kompleksitet enn virveldyr å forstå signaloverføringsveier og GRNs regulerer grunnleggende utviklingsmekanismer .. Mange laboratorier bruker lignende undersøkelser i løpet av tidlig kråkeboller utvikling for å dissekere signalveier involvert i andre arrangementer celle skjebne spesifikasjon (f.eks Notch, pinnsvin, TGF-β, og FGF signalering) ^27, <su…

Materials

Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino	Gene Tools LLC	Customized	More information at www.gene-tools.com
Glycerol	Invitrogen	15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)	Invitrogen, Life Technologies	D1821	Make 25mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
MOPS	Sigma Aldrich	M1254-250G
Tween-20	Sigma Aldrich	23336-0010
Formamide	Sigma Aldrich	47671-1L-F
Yeast tRNA	Invitrogen	15401-029
Normal Goat Serum	Sigma Aldrich	G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody	Roche	11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole)	Sigma Aldrich	L9756-5G
Tris Base UltraPure	Research Products Internationall Corp	56-40-6
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate	Roche	11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)	Roche	11 383 213 001
Dimethyl Formamide	Sigma Aldrich	D4551-500mL
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541-5KG
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761-500G
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	M7506-2KG
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016-500G