Rapid Isolatie van BMPR-IB + Adipose-afgeleide stromacellen voor gebruik in een calvarial Defect Healing Model
Summary
Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient’s own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.
Abstract
Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient’s own body. The ability to grow bone de novo using a patient’s own cells would allow bony defects to be filled with adequate tissue without the morbidity of harvesting native bone. There is interest in the use of adipose-derived stromal cells (ASCs) as a source for tissue engineering because these are obtained from an abundant source: the patient’s own adipose tissue. However, ASCs are a heterogeneous population and some subpopulations may be more effective in this application than others. Isolation of the most osteogenic population of ASCs could improve the efficiency and effectiveness of a bone engineering process. In this protocol, ASCs are obtained from subcutaneous fat tissue from a human donor. The subpopulation of ASCs expressing the marker BMPR-IB is isolated using FACS. These cells are then applied to an in vivo calvarial defect healing assay and are found to have improved osteogenic regenerative potential compared with unsorted cells.
Introduction
Grote botdefecten als gevolg van letsel, infectie of invasieve kanker hebben een aanzienlijke invloed op het herstel en de kwaliteit van het leven van een patiënt. Technieken bestaan om deze gebreken gezond bot vulling van elders in lichaam van de patiënt, maar deze overdracht draagt zijn eigen morbiditeit en risico van complicaties 1, 2, 3. Bovendien zijn sommige gebreken zo omvangrijk of complex die voldoende donorbot beschikbaar is om het defect te vullen. Protheses zijn een mogelijke optie voor het vullen van botdefecten, maar deze zijn geassocieerd met een aantal nadelen waaronder infectierisico werkende hardware en vreemd lichaam reactie 4.
Om deze redenen is er grote belangstelling voor de mogelijkheid van engineering van biologische botvervangers behulp van eigen cellen van de patiënt 5. -Vet-afgeleide stromale cellen (ASC)hebben potentieel voor deze toepassing, omdat zij overvloedig aanwezig in de eigen vetweefsel van de patiënt en ze hebben het vermogen om botdefecten te helen door het genereren van nieuw botweefsel 6, 7 getoond. ASC's zijn een diverse populatie van cellen en verscheidene studies hebben aangetoond dat het selecteren van specifieke celoppervlak markers celpopulaties met verhoogde osteogene activiteit 8, 9 kan produceren. ASC selecteren met het hoogste osteogeen potentieel zou de waarschijnlijkheid toenemen dat een scaffold bezaaid met deze cellen een grote botdefecten kan regenereren.
Bone morfogenetisch eiwit (BMP) signalering is essentieel voor het reguleren van differentiatie en bot- vorming 10 en het BMP receptor type IB (BMPR-IB) is bekend belangrijk voor osteogenese in ASCs 11 zijn. Onlangs hebben we aangetoond dat expressie van BMPR-IB kan be gebruikt om te selecteren voor het ASC met verhoogde osteogene activiteit 12. Hier laten we een protocol voor de isolatie van BMPR-IB tot expressie ASC's uit menselijk vet, gevolgd door een analyse van hun osteogene activiteit met een in vivo model calvarial defect.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen in het protocol
Tijdens de oogst van ASC, de kritische stap is voldoende vertering van vet met collagenase. Onvoldoende vertering leidt tot een lage opbrengst van ASC. Tijdens FACS sortering van BMPR-IB + cellen, is het belangrijk om de poort zorgvuldig definiëren positiviteit. Het definiëren poorten te los kan resulteren in gesorteerde populaties die niet zuiver zijn. Tijdens het maken van de calvarial defect, is het essentieel om het defect te boren door het bot van de sch…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.D.M. was supported by the American College of Surgeons (ACS) Resident Research Scholarship. M.S.H. was supported by the California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow training grant TG2-01159. M.S.H., H.P.L., and M.T.L. were supported by the American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS)/Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF) Research Grant Award. H.P.L. was supported by NIH grant R01 GM087609 and a gift from Ingrid Lai and Bill Shu in honor of Anthony Shu. H.P.L. and M.T.L. were supported by the Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine and The Oak Foundation. M.T.L. was supported by NIH grants U01 HL099776, R01 DE021683-01, and RC2 DE020771. D.C.W. was supported by NIH grant 1K08DE024269, the Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, and the Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.
Materials
| 100 micron cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 blade scalpel | Miltex | 4-515 | |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle, | Ethicon | 1698G | |
| Anti-BMPR-IB primary antibody | R&D systems | FAB5051A | |
| BioGel PI surgical gloves | Mölnlycke Health Care | ALA42675Z | |
| Buprenorphine SR | ZooPharm | ||
| Castro-Viejo needle driver | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| CD1 nude mouse | Charles River | 086 | |
| Collagenase Type II powder | Gibco | 17101-015 | |
| DMEM medium | Gibco | 10564-011 | |
| Drill: Circular knife 4.0 mm | Xemax Surgical | CK40 | |
| Drill: Z500 Brushless Micromotor | NSK | NSKZ500 | |
| FBS | Gicbo | 10437-077 | |
| Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-20 | |
| Hyclone 199/EBSS medium | GE Life Sciences | SH30253.01 | |
| Isothesia isoflurane | Henry Schein | 050033 | |
| Micro Forceps with teeth | Roboz | RS-5150 | |
| Micro Forceps with teeth | Roboz | RS-5150 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Bemis | PM996 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
| PLGA scaffolds | Proprietary Formulation | ||
| Poloxamer 188, 10% | Sigma | P5556-100ML | |
| Polylined Sterile Field, 18" x 24" | Busse Hospital Disposables | 696 | Cut a rectangular hole of the appropriate size |
| Polysucrose Solution: Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Medline | MDS093944H | |
| Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube | Dechra Veterinary Products | ||
| RBC lysis buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Webcol alcohol prep swabs | Covidien | 6818 |
Referências
- Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: an update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
- Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. Bone graft substitutes. Expert Rev Med Devices. 3 (1), 49-57 (2006).
- Walmsley, G. G., et al. Nanotechnology in bone tissue engineering. Nanomedicine. 11 (5), 1253-1263 (2015).
- Chapekar, M. S. Tissue engineering: challenges and opportunities. J Biomed Mater Res. 53 (6), 617-620 (2000).
- Levi, B., et al. Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects. PLoS One. 5 (6), e11177 (2010).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100 (9), 1249-1260 (2007).
- Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. J Biol Chem. 286 (45), 39497-39509 (2011).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells. Tissue Eng Part A. 19 (7-8), 989-997 (2013).
- Wozney, J. M., et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242 (4885), 1528-1534 (1988).
- Wan, D. C., et al. Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (33), 12335-12340 (2006).
- McArdle, A., et al. Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage. Tissue Eng Part A. 20 (21-22), 3031-3040 (2014).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (71), e4425 (2013).
- Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. J Vis Exp. (68), (2012).
- Lester, S. C. . Manual of surgical pathology. , (2010).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
