Schnelle Isolierung von BMPR-IB + Fettgewebe gewonnene Stromazellen für die Verwendung in einem Schädeldachdefektheilung Modell
Summary
Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient’s own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.
Abstract
Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient’s own body. The ability to grow bone de novo using a patient’s own cells would allow bony defects to be filled with adequate tissue without the morbidity of harvesting native bone. There is interest in the use of adipose-derived stromal cells (ASCs) as a source for tissue engineering because these are obtained from an abundant source: the patient’s own adipose tissue. However, ASCs are a heterogeneous population and some subpopulations may be more effective in this application than others. Isolation of the most osteogenic population of ASCs could improve the efficiency and effectiveness of a bone engineering process. In this protocol, ASCs are obtained from subcutaneous fat tissue from a human donor. The subpopulation of ASCs expressing the marker BMPR-IB is isolated using FACS. These cells are then applied to an in vivo calvarial defect healing assay and are found to have improved osteogenic regenerative potential compared with unsorted cells.
Introduction
Wichtige Knochendefekten aus der Verletzung, Infektion oder invasiven Krebs haben einen erheblichen Einfluss auf eines Patienten Erholung und Lebensqualität. Es gibt Techniken , um diese Defekte mit gesunden Knochen von einer anderen Stelle des Patienten eigenen Körper, aber diese Übertragung trägt seine eigene Morbidität und das Risiko von Komplikationen 1, 2, 3 zu füllen. Darüber hinaus sind einige Mängel so groß oder komplex, dass genügend Spenderknochen vorliegt, um den Defekt zu füllen. Prosthetic Geräte sind eine mögliche Option für Knochendefekte Füllung , aber diese sind mit mehreren Nachteilen , einschließlich Infektionsrisiko, Hardware – Fehler zugeordnet ist , und Fremdkörperreaktion 4.
Aus diesen Gründen besteht ein großes Interesse an der Möglichkeit von Engineering biologischen Knochenersatzmaterialien von patienteneigenen Zellen 5 verwendet wird . Adipöse abgeleiteten Stromazellen (ASC)haben das Potenzial für diese Anwendung , da sie reichlich vorhanden in den patienteneigenen Fettgewebe sind , und sie haben die Fähigkeit zu heilen Knochendefekte nachgewiesen durch die Generierung neuer Knochengewebe 6, 7. ASCs sind eine heterogene Population von Zellen , und mehrere Studien haben gezeigt , dass für bestimmte Zelloberflächenmarker 8 Auswählen Zellpopulationen mit einer verbesserten osteogenen Aktivität produzieren kann, 9. ASCS mit dem höchsten osteogene Potenzial Auswahl würde die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass ein Gerüst mit diesen Zellen ausgesät könnte einen großen Knochendefekt zu regenerieren.
Bone morphogenetic protein (BMP) Signalisierungs ist kritisch für die Regulierung Knochendifferenzierung und die Bildung 10 und den BMP – Rezeptor Typ IB (BMPR-IB) ist bekannt für die Osteogenese in ASCs 11 wichtig. Vor kurzem haben wir, dass die Expression von BMPR-IB gezeigt, kann be 12 verwendet für ASCS mit verbesserten osteogenen Aktivität auszuwählen. Hier zeigen wir ein Protokoll für die Isolierung von ASCs aus menschlichem Fett durch einen Test ihrer osteogene Aktivität gefolgt BMPR-IB-exprimierenden unter Verwendung eines in vivo Calvaria Defektmodell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls
Während der Ernte der ASCs, ist der kritische Schritt ausreichende Verdauung von Fett mit Kollagenase. Eine unzureichende Verdauung wird in einer geringen Ausbeute an ASCS führen. Während der FACS-Sortierung von BMPR-IB + Zellen ist es wichtig, das Tor für Positivität sorgfältig zu definieren. Tore zu lose Definition in sortierten Populationen resultieren, die nicht rein sind. Bei der Erstellung des Kalvariamodell Defekt, ist es entscheidend, de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.D.M. was supported by the American College of Surgeons (ACS) Resident Research Scholarship. M.S.H. was supported by the California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow training grant TG2-01159. M.S.H., H.P.L., and M.T.L. were supported by the American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS)/Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF) Research Grant Award. H.P.L. was supported by NIH grant R01 GM087609 and a gift from Ingrid Lai and Bill Shu in honor of Anthony Shu. H.P.L. and M.T.L. were supported by the Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine and The Oak Foundation. M.T.L. was supported by NIH grants U01 HL099776, R01 DE021683-01, and RC2 DE020771. D.C.W. was supported by NIH grant 1K08DE024269, the Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, and the Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.
Materials
| 100 micron cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 blade scalpel | Miltex | 4-515 | |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle, | Ethicon | 1698G | |
| Anti-BMPR-IB primary antibody | R&D systems | FAB5051A | |
| BioGel PI surgical gloves | Mölnlycke Health Care | ALA42675Z | |
| Buprenorphine SR | ZooPharm | ||
| Castro-Viejo needle driver | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| CD1 nude mouse | Charles River | 086 | |
| Collagenase Type II powder | Gibco | 17101-015 | |
| DMEM medium | Gibco | 10564-011 | |
| Drill: Circular knife 4.0 mm | Xemax Surgical | CK40 | |
| Drill: Z500 Brushless Micromotor | NSK | NSKZ500 | |
| FBS | Gicbo | 10437-077 | |
| Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-20 | |
| Hyclone 199/EBSS medium | GE Life Sciences | SH30253.01 | |
| Isothesia isoflurane | Henry Schein | 050033 | |
| Micro Forceps with teeth | Roboz | RS-5150 | |
| Micro Forceps with teeth | Roboz | RS-5150 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Bemis | PM996 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
| PLGA scaffolds | Proprietary Formulation | ||
| Poloxamer 188, 10% | Sigma | P5556-100ML | |
| Polylined Sterile Field, 18" x 24" | Busse Hospital Disposables | 696 | Cut a rectangular hole of the appropriate size |
| Polysucrose Solution: Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Medline | MDS093944H | |
| Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube | Dechra Veterinary Products | ||
| RBC lysis buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Webcol alcohol prep swabs | Covidien | 6818 |
Referências
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