The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.
During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the “segmentation clock,” acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as “kymographs,” for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.
Somitter er de første segmenter dannet i forlængede kropsakse i udviklingen vertebrater og er forløbere af rygsøjlen, ribben, og dermis væv, såvel som af muskel og endotelceller. Under somitogenesis, epitel somitter dannes fra unsegmented presomitic mesoderm (PSM) (revideret i reference 1). Denne proces er reguleret af "segmentering ur", som består af et netværk af oscillerende gener og proteiner, for det meste tilhører Notch signalvejen. Segmenteringen Uret består af forskellige negative feedback-loops, der muliggør pulserende produktion af Notch aktivitet inden for en enkelt celle 2 (revideret i Referencer 3. – 6.). Mens den intracellulære fremgangsmåde til oscillation er godt karakteriseret, er det stadig ukendte hvordan disse svingninger er koordinerede tværs af PSM væv. Det har for nylig vist, gennem både eksperimentelle og teoretiske undersøgelser, at disse svingninger er essential til processen med somitogenesis og at Notch-vejen spiller en afgørende rolle i processen med både segmentering og svingende genekspression 7, 8. Det har imidlertid været meget rapporteret, at Notch-receptor 1 (Notch1) og Delta-lignende ligand (Dll) -1 har statiske gradienter i PSM 9, 10, 11.
Vi antager, at Notch-afhængige svingninger af PSM segmentering ur afhænge periodisk aktivering af de vigtigste Notch pathway receptor og ligand, Notch1 og Dll1 henholdsvis på tværs af muse PSM. Konklusionerne fra tidligere undersøgelser, der er rapporteret en statisk rostralt-caudale gradient af disse proteiner skyldtes, forudser vi, at en manglende følsomhed i Immunofarvning teknikker. De var derfor ikke registrere udsving Dll1 og Notch1 lavt niveau i caudale PSM.
Vi have udtænkt en metode til mere nøje undersøge disse faktorer, der kombinerer eksperimentelle data med matematisk modellering til at forudsige en mekanisme, hvorved svingninger af proteiner af ur komponenter koordineres på tværs af PSM 12.
Det overordnede mål med denne metode er at påvise og bestemme lavt niveau, dynamisk proteinekspression i PSM og kortlægge udtrykket profiler af proteiner af interesse i henhold til ekspression af det kendte ur-gen, Lunatic frynser (Lfng). Da en cyklus af segmenteringen uret i muse embryo tager 2 h for at afslutte, er forskellige prøver kræves for at opbygge et fuldstændigt Spatiotemporal profil Dll1 og Notch1 proteinekspression under en Lfng oscillation i PSM. Vi har derfor udviklet denne protokol til at muliggøre high-throughput påvisning af lav-niveau proteinekspression i hel-mount, kontralaterale PSM eksplantater. Imidlertid kan denne teknik også være nyttigt for undersøgelser that til formål at karakterisere lavniveau protein dynamik inden for enhver embryonale væv, der kan opdeles i kontralaterale halvdele.
Kritiske trin i protokollen
Den nuværende protokol beskriver en følsom metode til at udføre kvantitativ analyse af lav-niveau protein udtryk og oscillerende dynamik i E10.5 mus PSM eksplantater. En robust protokol for både immunhistokemi og fluorescerende in situ hybridisering (FISH) er efterfulgt af høj opløsning hel-mount konfokal billeddannelse, og derefter ved billedanalyse og tidsmæssige segmentering af kymographs at generere en spatiotemporale kort over proteinekspression tværs af PSM. Et højt signal-til-støj-forhold i protein og mRNA detektion er afgørende for at sikre succes for denne teknik. Der skal udvises omhu for at grundigt udveksle alle løsninger effektivt i de vasketrin og til at holde temperaturen af de 65 ° C vask i de relevante faser af trin 3. Det er mest fordelagtigt at tage sig tid til at kilde effektive antistoffer og RNA-prober mod mål af interesse, og at teste disse reagensergrundigt på hele-mount prøver forud for starter denne protokol.
Ændringer og fejlfinding
De vigtigste problemer, der kan opstå, når du udfører denne protokol skyldes dårligt signal afsløring styrke og kvalitet. Dette afhænger i høj grad af effektiviteten af de antistoffer eller RNA-prober anvendes til immunhistokemi eller fisk trin i protokollen, hhv. Et antal forskellige trin kan kræve optimering, før der opnås tilstrækkelig detekteringssignal. En almindelig årsag til dårlig detektion signal er forkert fiksering; Det er bydende nødvendigt, at enten friske PFA eller PFA opbevares ved 4 ° C i ikke mere end en uge bruges til at fastsætte prøverne. Længden af fiksering kan også kræve optimering, afhængigt af antistoffet eller RNA-probe anvendt. For antistoffer, anbefales det at følge producentens anvisninger om muligt, mens det for RNA-prober, vi rådgive høring af den offentliggjorte litteratur.
<p class = "jove_content"> I denne undersøgelse anvendte vi en RNA-probe, der specifikt detekterer præ-mRNA af uret genet Lfng. På grund af sin relative mangel på overflod, påvisning af Lfng præ-mRNA kræver en lang periode med inkubation med sonden i hybridiseringsblanding indeholdende 5x saltvand-natriumcitrat (SSC) for godt signal detektion. De samme betingelser kan gælde for andre sonder, der registrerer svagt udtrykte mRNA'er, men vores erfaring, kan påvisning af mere stabile mRNA-mål kræver en kortere probehybridisering trin og lavere SSC koncentrationer i hybridisering mix (f.eks 1,3x SSC). For både immunhistokemi og fisk, skal protokollen først optimeres på hele embryoner, og den optimale koncentration af antistof eller proben skal bestemmes empirisk.Begrænsninger af teknikken
Som nævnt ovenfor succesen af denne teknik er stærkt afhængig af kvaliteten af proteinet og mRNA-detektion. We har skitseret en række forslag til, hvordan protein og mRNA detektion kan forbedres, men i mangel af høj kvalitet fluorescerende signal detektion, er der ingen måde eksperimentet kan fortsætte. Antallet af proteinmål der kan analyseres i hver vævsprøve er begrænset af den spektrale opløsning af det konfokale mikroskop og ved epitoperne af de anvendte antistoffer. I denne undersøgelse, var vi i stand til at bruge op til tre epitoper for protein detektion sammen med en DNA-plet på hver prøve 12. Denne protokol tillader kun påvisningen af en mRNA target Selv om de nuværende alternative metoder kunne anvendes til at øge dette til op til tre mål 14.
Betydningen af Teknik med Respekt for eksisterende / Alternative Metoder
Den her beskrevne metode giver en følsom teknik til at opdage protein udsving lavt niveau i hele-mount PSM-eksplantater. Den kvantificering af disse dynamikker ermuligt ved at udføre FISH for et kendt ur-gen i tilsvarende kontralaterale eksplantater. Et bibliotek af kymographs genereres der kan organiseres over en segmentering taktcyklus, fremhæve de spatiotemporale udtryk dynamikken i et mål af interesse inden for denne tidsramme. En afgørende forskel i denne teknik frem for andre er brugen af beregningsmæssige automatisering til tidsmæssigt bestille store datasæt, som tillader spatiotemporale udtryk dynamik nye ur komponenter, der skal analyseres i en saglig måde. For eksempel denne teknik forudsat indsigt i, hvordan Dll1 og Notch1 proteiner og deres svingninger er co-reguleret over hele PSM. Alternative metoder i denne sammenhæng har også påberåbt immunfarvning, men de havde ikke registrere de små udsving i Dll1 og Notch1 protein niveauer i caudale PSM, der var tydeligt ved hjælp af denne metode. I stedet er de rapporterede en stabil gradient af udtryk, der er stærkest i rostrale område 9 <sop>, 10, 11. Dette kan skyldes det faktum, at denne protokol har en længere primært antistof inkubationsperiode (3 – 5 døgn, i modsætning til natten over), som kan kræves for at detektere lavere niveauer af protein. Da niveauet af Dll1 og Notch1 udtryk er relativt høje i rostralt PSM, kan dette have påvirket forfatterne til billedet prøverne til en lavere eksponering indstilling end ville være nødvendige for at detektere caudale proteinekspression. En yderligere potentiel uoverensstemmelse skyldes brugen af ikke-fikserede væv i undersøgelsen fra Chapman et al. , Hvor forbigående udtryk for Dll1 og Notch1 i caudale PSM kan have været mindre velbevaret 9.
Fremtidige Programmer eller vejvisning efter Mastering Teknik
Når denne protokol er blevet beherskes, kan high-throughput ekspressionsanalyse udføres for ethvert protein af interesse i PSM.PSM eksplantater genereret fra flere mus kuld kan behandles på en gang for at generere det høje antal stikprøver nødvendigt, til analyse. Selvom vi kun har brugt vildtype embryoner i disse studier, er det muligt at udføre denne analyse ved anvendelse af genetisk modificerede embryoner for at vurdere vigtigheden af en eller flere faktorer på proteinekspressionsplasmider dynamik. Ud over PSM, kan denne protokol tilpasses til andre systemer, der er sammensat af to kontralaterale halvdele og kan anvendes til følsomt detektere lavniveau proteinekspression og oscillerende dynamik. Et eksempel for hvilke denne protokol kan tilpasses er studiet af dynamiske proteinekspression i muse neuralrøret, eftersom kontralaterale halvdele kunne genereres og dyrkes, og Notch-aktivitet er blevet vist at være både nuværende og vigtige for mønsterdannelse 15. Vi opfordrer andre grupper til at tilpasse denne protokol til andre systemer, og for at give feedback til fremtidige forbedringer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en MRC studentship til RAB, en MRC studentship til CSLB, og en WT projekt tilskud til JKD (WT089357MA). Arbejdet blev også støttet af en Welcome Trust Strategisk award (097.945 / Z / 11 / Z). Vi takker Dr. E. Kremmer for den slags gave Dll1 antistof og Dr. O. Pourquie for Lfng RNA-probe.
DMEM-F12 | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 11320033 | |
GlutaMAX™-1 (100X) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 35050 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10270106 | |
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140122 | |
anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^ | BD Pharmingen | 552466 | |
anti-rat polyclonal Dll1 antibody^* | N/A | N/A | |
Lfng intronic anti-sense RNA probe^* | N/A | N/A | |
16% paraformaldehyde | Pierce (ThermoFischer Scientific) | PI28908 | |
Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche (Sigma-Aldrich) | 31158 | |
Phosphate buffered saline (PBS), pH7.4 | Made in house | N/A | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
Normal goat serum (NGS) (heat-treated) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 16210072 | |
Hoechst 33342 | ThermoFischer Scientific | H3570 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 46139 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
Saline-sodium citrate (SSC) | Sigma-Aldrich | 93017 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | |
tRNA | Roche (Sigma-Aldrich) | 101095 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
Tris-buffered saline (TBS) | Made in house | N/A | |
Blocking Buffer Reagent | Roche (Sigma-Aldrich) | 11096176001 | |
anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody | Roche (Sigma-Aldrich) | 11207733910 | |
Tyramide signal amplification (TSA) kit | Perkin Elmer | NEL744001KT | |
*NOTE: The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources. | |||
^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader. |