The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.
During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the “segmentation clock,” acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as “kymographs,” for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.
Somites डर्मिस ऊतक, साथ ही मांसपेशियों और endothelial कोशिकाओं के हड्डीवाला प्रजातियों को विकसित करने में elongating शरीर अक्ष में गठित पहली क्षेत्रों रहे हैं और रीढ़ की हड्डी, पसलियों के पूर्ववर्ती हैं, और। somitogenesis के दौरान उपकला somites अनुभाग-रहित presomitic mesoderm (पी एस एम) (संदर्भ 1 में समीक्षा) से के रूप में। इस प्रक्रिया oscillatory जीन और प्रोटीन के एक नेटवर्क के होते हैं, जो ज्यादातर पायदान संकेतन मार्ग से संबंधित "विभाजन घड़ी," द्वारा नियंत्रित किया जाता है। (संदर्भ में समीक्षा की 3 – 6) विभाजन घड़ी विभिन्न नकारात्मक प्रतिक्रिया छोरों है, जो एक एकल कोशिका के भीतर 2 पायदान गतिविधि के गुणवाला उत्पादन में सक्षम होते हैं। दोलन के intracellular विधि अच्छी तरह से होती है, यह अभी भी काफी हद तक अनजान कैसे इन दोलनों पी एस एम ऊतक भर में समन्वय कर रहे है। यह हाल ही में दिखाया गया है, प्रायोगिक और सैद्धांतिक दोनों अध्ययन के माध्यम से, कि इन दोलनों आवश्यक तत्व हैंपायदान मार्ग somitogenesis की प्रक्रिया के लिए और कहा कि एल दोनों विभाजन और oscillatory जीन अभिव्यक्ति 7, 8 की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हालांकि, यह व्यापक रूप से है कि पायदान रिसेप्टर 1 (Notch1) और सूचित किया गया है डेल्टा-तरह ligand (DLL) -1 पी एस एम 9, 10, 11 में स्थिर ढ़ाल है।
हम धारणा है कि पी एस एम विभाजन घड़ी की पायदान पर निर्भर दोलनों मुख्य मार्ग पायदान रिसेप्टर और ligand, Notch1 और Dll1, की आवधिक सक्रियण पर निर्भर क्रमश: माउस पी एस एम के पार। पिछले अध्ययनों का निष्कर्ष है कि इन प्रोटीनों की एक स्थिर व्याख्यान चबूतरे वाला दुम ढाल सूचना कारण थे, हम immunostaining तकनीक में संवेदनशीलता की कमी की भविष्यवाणी। वे इसलिए दुम पी एस एम में Dll1 और Notch1 के निम्न स्तर के उतार-चढ़ाव का पता लगाने में असमर्थ थे।
हमारे पासई एक विधि तैयार और अधिक बारीकी से इन कारकों की जांच करने, गणितीय मॉडलिंग के साथ प्रयोगात्मक डेटा के संयोजन एक व्यवस्था है जिसके द्वारा घड़ी घटकों के प्रोटीन के दोलनों पी एस एम 12 के पार समन्वय कर रहे हैं भविष्यवाणी करने के लिए।
इस विधि के समग्र लक्ष्य का पता लगाने और पी एस एम में निम्न स्तर के, गतिशील प्रोटीन अभिव्यक्ति यों और ज्ञात घड़ी जीन की अभिव्यक्ति के अनुसार ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल नक्शा करने के लिए है, पागल फ्रिंज (Lfng)। चूंकि माउस भ्रूण में विभाजन घड़ी का एक चक्र पूरा करने के लिए 2 घंटे लगते हैं, विभिन्न नमूनों पी एस एम में एक Lfng दोलन के दौरान Dll1 और Notch1 प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक पूरा spatiotemporal प्रोफ़ाइल बनाने के लिए आवश्यक हैं। हम इस प्रकार पूरे माउंट में निम्न स्तर के प्रोटीन अभिव्यक्ति, contralateral पी एस एम explants की उच्च throughput का पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए इस प्रोटोकॉल विकसित किया है। हालांकि, इस तकनीक को भी पढ़ाई के टी के लिए उपयोगी हो सकता हैटोपी किसी भी भ्रूण ऊतक कि contralateral हिस्सों में विभाजित किया जा सकता भीतर निम्न स्तर प्रोटीन गतिशीलता को चिह्नित करने का लक्ष्य है।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
वर्तमान प्रोटोकॉल एक संवेदनशील तरीका E10.5 माउस पी एस एम explants में निम्न स्तर के प्रोटीन अभिव्यक्ति और oscillatory गतिशीलता के मात्रात्मक विश्लेषण प्रदर्शन करने का वर्णन है। दोनों immunohistochemistry और सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल उच्च संकल्प द्वारा पीछा किया जाता है पूरे माउंट confocal इमेजिंग, और फिर छवि विश्लेषण और kymographs के अस्थायी विभाजन से पी एस एम भर में प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक spatiotemporal नक्शे उत्पन्न करने के लिए। प्रोटीन और mRNA का पता लगाने में एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात इस तकनीक की सफलता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। देखभाल अच्छी तरह से चरण 3 के प्रासंगिक चरणों में धोने के चरणों के दौरान प्रभावी रूप से सभी के समाधान के आदान प्रदान और 65 डिग्री सेल्सियस washes के तापमान को बनाए रखने के लिए लिया जाना चाहिए यह समय स्रोत के लिए प्रभावशाली एंटीबॉडी और आरएनए के खिलाफ जांच लेने के लिए सबसे फायदेमंद है ब्याज की और लक्ष्य इन अभिकर्मकों परीक्षण करने के लिएअच्छी तरह से पूरे माउंट नमूने इस प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले पर।
संशोधन और समस्या निवारण
मुख्य मुद्दों है कि जब इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन का सामना करना पड़ा हो सकता है गरीब संकेत का पता लगाने ताकत और गुणवत्ता से उत्पन्न होती हैं। यह काफी हद तक एंटीबॉडी या आरएनए जांच, क्रमशः प्रोटोकॉल में immunohistochemistry या मछली कदम के लिए इस्तेमाल की प्रभावकारिता पर निर्भर है। पहले पर्याप्त संकेत का पता लगाने हासिल की है विभिन्न चरणों के एक नंबर अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। गरीब संकेत का पता लगाने के लिए एक आम कारण अनुचित निर्धारण होता है; यह जरूरी है कि या तो ताजा पीएफए या पीएफए कोई भी तुलना में अब सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत नमूनों को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। निर्धारण की लंबाई भी इस्तेमाल किया एंटीबॉडी या आरएनए जांच पर निर्भर करता है, अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। एंटीबॉडी के लिए, यह संभव जहां निर्माता के निर्देशों का पालन करने के लिए है, जबकि आरएनए जांच के लिए, हम प्रकाशित साहित्य के परामर्श को सलाह देने की सलाह दी है।
<p clasएस = "jove_content"> इस अध्ययन में, हम एक शाही सेना जांच है कि विशेष रूप से घड़ी जीन Lfng के पूर्व mRNA का पता लगाता है इस्तेमाल किया। बहुतायत के अपने रिश्तेदार की कमी के कारण, Lfng पूर्व mRNA का पता लगाने के संकरण अच्छा संकेत का पता लगाने के लिए 5x खारा सोडियम साइट्रेट (एसएससी) युक्त मिश्रण में जांच के साथ ऊष्मायन की एक लंबी अवधि की आवश्यकता है। एक ही परिस्थितियों अन्य जांच जो दुर्बलता से व्यक्त mRNAs पता लगाने के लिए आवेदन कर सकते हैं, लेकिन हमारे अनुभव में, अधिक स्थिर mRNA लक्ष्य का पता लगाने संकरण मिश्रण में एक छोटा जांच संकरण कदम और कम एसएससी सांद्रता (जैसे, 1.3x एसएससी) की आवश्यकता हो सकती है। दोनों immunohistochemistry और मछली के लिए, प्रोटोकॉल पहले पूरे भ्रूण पर अनुकूलित किया जाना चाहिए, और एंटीबॉडी या जांच के इष्टतम एकाग्रता अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए।तकनीक की सीमाएं
जैसा कि ऊपर कहा, इस तकनीक की सफलता प्रोटीन और mRNA का पता लगाने की गुणवत्ता पर निर्भर है। डब्ल्यूई कैसे प्रोटीन और mRNA पता लगाने में सुधार किया जा सकता है के रूप में कई सुझाव रेखांकित किया है, लेकिन उच्च गुणवत्ता फ्लोरोसेंट संकेत का पता लगाने के अभाव में, वहाँ कोई रास्ता प्रयोग आगे बढ़ सकते है। प्रोटीन लक्ष्य की संख्या कि प्रत्येक ऊतक के नमूने में विश्लेषण किया जा सकता confocal खुर्दबीन के वर्णक्रमीय संकल्प से और इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के epitopes द्वारा सीमित है। इस अध्ययन में, हम प्रत्येक नमूना 12 पर एक डीएनए दाग के साथ प्रोटीन का पता लगाने के लिए तीन epitopes करने के लिए उपयोग करने में सक्षम थे। इस प्रोटोकॉल केवल एक mRNA लक्ष्य का पता लगाने के लिए परमिट हालांकि वर्तमान वैकल्पिक तरीकों के लिए तीन ठिकानों 14 को यह बढ़ाने के लिए नियोजित किया जा सकता है।
मौजूदा / वैकल्पिक तरीके के लिए सम्मान के साथ तकनीक का महत्व
विधि यहाँ वर्णित एक संवेदनशील तकनीक पूरे माउंट पी एस एम explants में निम्न स्तर के उतार चढ़ाव प्रोटीन का पता लगाने के लिए प्रदान करता है। इन गतिशीलता की मात्रा का ठहराव हैcontralateral explants इसी में एक ज्ञात घड़ी जीन के लिए मछली के प्रदर्शन से संभव है। kymographs के एक पुस्तकालय उत्पन्न होता है कि एक विभाजन घड़ी चक्र से अधिक का आयोजन किया जा सकता है, इस समय सीमा के भीतर ब्याज का लक्ष्य के spatiotemporal अभिव्यक्ति की गतिशीलता पर प्रकाश डाला। दूसरों पर इस तकनीक में एक महत्वपूर्ण अंतर कम्प्यूटेशनल स्वचालन के उपयोग के अस्थायी बड़े डेटा सेट है, जो उपन्यास घड़ी घटकों के spatiotemporal अभिव्यक्ति की गतिशीलता एक निष्पक्ष तरीके से विश्लेषण किया जा करने के लिए परमिट व्यवस्था करने के लिए है। उदाहरण के लिए, इस तकनीक को कैसे Dll1 और Notch1 प्रोटीन और उनके दोलनों सह विनियमित पूरे पी एस एम पार कर रहे हैं में अंतर्दृष्टि प्रदान की है। इस संदर्भ में वैकल्पिक तरीकों में भी immunostaining पर भरोसा किया है, लेकिन वे Dll1 और Notch1 दुम पी एस एम में प्रोटीन का स्तर है कि इस पद्धति का उपयोग स्पष्ट किया गया है में छोटे उतार चढ़ाव का पता नहीं लगा था। इसके बजाय, वे अभिव्यक्ति की एक सतत ढाल कि व्याख्यान चबूतरे वाला क्षेत्र 9 में सबसे मजबूत है सूचना <sअप>, 10, 11। (- 5 दिन, के रूप में करने के लिए रात का विरोध किया 3), जो प्रोटीन के निचले स्तर पर पता लगाने के लिए आवश्यक हो सकता है इस तथ्य को इस प्रोटोकॉल एक लंबी प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन अवधि है की वजह से हो सकता है। Dll1 और Notch1 अभिव्यक्ति के स्तर पर व्याख्यान चबूतरे पी एस एम में अपेक्षाकृत अधिक हैं, इस छवि के लिए लेखकों को एक कम जोखिम की तुलना में स्थापित करने पर नमूने दुम प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए आवश्यक होगा प्रभावित हो सकता है। एक संभावित विसंगति फेरीवाला एट अल द्वारा अध्ययन में unfixed ऊतक के उपयोग से उत्पन्न होती है। है, जिसमें दुम पी एस एम में Dll1 और Notch1 की क्षणभंगुर अभिव्यक्ति कम अच्छी तरह से संरक्षित किया गया है 9 मई।
भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश तकनीक माहिर के बाद
एक बार जब इस प्रोटोकॉल में महारत हासिल किया गया है, उच्च throughput अभिव्यक्ति विश्लेषण पी एस एम में ब्याज की किसी भी प्रोटीन के लिए किया जा सकता है।कई माउस litters से उत्पन्न पी एस एम explants एक बार में कार्रवाई की जा सकती उच्च नमूना विश्लेषण के लिए आवश्यक संख्या उत्पन्न करने के लिए। हालांकि हम केवल इन अध्ययनों में जंगली प्रकार के भ्रूण का इस्तेमाल किया है, यह क्रम में प्रोटीन अभिव्यक्ति गतिशीलता पर एक या एक से अधिक कारकों के महत्व का आकलन करने में इस विश्लेषण आनुवंशिक रूप से संशोधित भ्रूण का उपयोग कर प्रदर्शन करने के लिए संभव है। पी एस एम के अलावा, इस प्रोटोकॉल अन्य प्रणालियों है कि दो contralateral हिस्सों से बना रहे हैं और संवेदनशीलता कम स्तर प्रोटीन अभिव्यक्ति और oscillatory गतिशीलता का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। के बाद से contralateral हिस्सों उत्पन्न किया जा सकता है और सुसंस्कृत, और पायदान गतिविधि दोनों वर्तमान और patterning 15 के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए दिखाया गया है इसका एक उदाहरण है, जिसके लिए इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, माउस न्यूरल ट्यूब में गतिशील प्रोटीन अभिव्यक्ति का अध्ययन है। हम अन्य समूहों के अन्य प्रणालियों के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूल करने के लिए और भविष्य में सुधार के लिए राय देने के लिए प्रोत्साहित करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस काम के लिए एक शाही एमआरसी छात्रवृत्ति, CSLB के लिए एक एमआरसी छात्रवृत्ति, और JKD (WT089357MA) के लिए एक गुम्मट परियोजना अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। काम भी एक वेलकम ट्रस्ट सामरिक पुरस्कार (097945 / Z / 11 / जेड) द्वारा समर्थित किया गया। हम Dll1 एंटीबॉडी और Lfng आरएनए जांच के लिए डॉ ओ Pourquie की तरह का उपहार के लिए डॉ ई Kremmer धन्यवाद।
DMEM-F12 | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 11320033 | |
GlutaMAX™-1 (100X) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 35050 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10270106 | |
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140122 | |
anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^ | BD Pharmingen | 552466 | |
anti-rat polyclonal Dll1 antibody^* | N/A | N/A | |
Lfng intronic anti-sense RNA probe^* | N/A | N/A | |
16% paraformaldehyde | Pierce (ThermoFischer Scientific) | PI28908 | |
Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche (Sigma-Aldrich) | 31158 | |
Phosphate buffered saline (PBS), pH7.4 | Made in house | N/A | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
Normal goat serum (NGS) (heat-treated) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 16210072 | |
Hoechst 33342 | ThermoFischer Scientific | H3570 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 46139 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
Saline-sodium citrate (SSC) | Sigma-Aldrich | 93017 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | |
tRNA | Roche (Sigma-Aldrich) | 101095 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
Tris-buffered saline (TBS) | Made in house | N/A | |
Blocking Buffer Reagent | Roche (Sigma-Aldrich) | 11096176001 | |
anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody | Roche (Sigma-Aldrich) | 11207733910 | |
Tyramide signal amplification (TSA) kit | Perkin Elmer | NEL744001KT | |
*NOTE: The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources. | |||
^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader. |