The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.
During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the “segmentation clock,” acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as “kymographs,” for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.
Somiter är de första segmenten är utformade i elongating kroppsaxel i utvecklings ryggradsdjur och är föregångare av ryggraden, revben och dermis vävnad, såväl som av muskel och endotelceller. Under somitogenesis, epitelceller somites bildar från unsegmented presomitic mesoderm (PSM) (översikt i ref 1). Denna process regleras av "segmente klocka", som består av ett nätverk av oscillerande gener och proteiner, för det mesta som hör till Notch-signalvägen. Segmente klockan består av olika negativa återkopplingsslingor, som möjliggör pulserande produktionen av Notch aktivitet inom en enda cell 2 (granskas i Referenser 3-6). Medan den intracellulära metod för oscillation är väl karakteriserad, är det fortfarande till stor del okänt hur dessa svängningar är koordinerade över PSM vävnad. Det har nyligen visats genom både experimentella och teoretiska studier, att dessa svängningar är essential till processen för somitogenesis och att Notch-vägen spelar en avgörande roll i processen för att både segmentering och oscillerande genexpression 7, 8. Emellertid har det varit allmänt rapporterats att Notch-receptor 1 (Notch1) och Delta-liknande ligand (Dll) -1 har statiska gradienter i PSM 9, 10, 11.
Vi antar att Notch beroende svängningar i PSM segmente klockan beror på den återkommande aktivering av huvud Notch vägen receptor och ligand, Notch1 och Dll1 respektive över musen PSM. Slutsatserna från tidigare studier som rapporterade en statisk rostralt-caudal gradient av dessa proteiner berodde vi förutse, till en brist på känslighet i immunfärgning tekniker. De var därför inte upptäcka låg nivå fluktuationer i Dll1 och Notch1 i stjärtfenan PSM.
vi have utarbetat en metod för att närmare undersöka dessa faktorer, som kombinerar experimentella data med matematisk modellering för att förutsäga en mekanism genom vilken svängningar av proteinerna av komponenter klock samordnas över PSM 12.
Det övergripande målet med denna metod är att detektera och kvantifiera låg nivå, dynamiska proteinuttryck i PSM och att kartlägga uttryck profiler av proteiner av intresse enligt uttrycket av den kända klock genen Lunatic frans (Lfng). Sedan en cykel av segmente klockan i musembryo tar två timmar att slutföra, är olika prover som krävs för att bygga en komplett Spatiotemporal profil Dll1 och Notch1 proteinuttryck under en Lfng svängning i PSM. Vi har därför utvecklat detta protokoll för att möjliggöra hög genomströmning detektion av lågaktivt proteinuttryck i hela-fäste, kontra PSM explants. Emellertid kan denna teknik även vara användbar för studier thatt syftar till att karakterisera låg nivå proteindynamik inom en embryonal vävnad som kan delas upp i kontralaterala halvor.
Kritiska steg i protokollet
Det nuvarande protokollet beskriver en känslig metod för att utföra kvantitativ analys av lågaktivt proteinuttryck och oscillerande dynamik i E10.5 mus PSM explants. En robust protokoll för både immunohistokemi och fluorescerande in situ hybridisering (FISH) följs av högupplösande hela montering konfokala imaging, och sedan genom bildanalys och tidssegmentering av kymographs att generera en Spatiotemporal karta över proteinuttryck över PSM. En hög signal-brusförhållande på protein och mRNA upptäckt är avgörande för att nå framgång med denna teknik. Man måste vara försiktig för att grundligt utbyta alla lösningar på ett effektivt sätt under tvättstegen och att hålla temperaturen på 65 ° C tvättar i de relevanta stadierna av steg 3. Det är mest fördelaktigt att ta tid att köpa effektiva antikroppar och RNA-sonder mot mål av intresse och för att testa dessa reagensnoggrant på hela montering prover innan du börjar detta protokoll.
Ändringar och felsökning
De viktigaste frågorna som kan uppstå när du utför detta protokoll uppstår dålig styrka och kvalitet signaldetektering. Detta är till stor del beroende på effekten av antikropparna eller RNA-prober som används för immunohistokemi eller fisk steg i protokollet, respektive. Ett antal olika åtgärder kan kräva optimering innan tillräcklig signaldetektering uppnås. En vanlig orsak till dålig signaldetektering är felaktig fixering; Det är absolut nödvändigt att antingen färsk PFA eller PFA lagras vid 4 ° C under en längre tid än en vecka används för att fixera proverna. Längden av fixering kan också kräva optimering, beroende på den antikropp eller RNA-prob användas. För antikroppar, är det tillrådligt att följa tillverkarens anvisningar när så är möjligt, medan RNA-prober, rekommenderar vi samråd med publicerad litteratur.
<p class = "jove_content"> I denna studie använde vi en RNA-sond som specifikt detekterar pre-mRNA av klock genen Lfng. På grund av dess relativa brist på överflöd, detektion av Lfng pre-mRNA kräver en lång period av inkubation med sonden i hybridiseringsblandning innehållande 5x saltlösning-natriumcitrat (SSC) för god signaldetektering. Samma villkor kan gälla för andra prober som detekterar svagt uttryckta mRNA, men vår erfarenhet, kan detektion av stabilare mRNA-mål kräver en kortare probhybridisering steg och lägre SSC koncentrationer i hybridiseringsblandning (t.ex. 1,3x SSC). För både immunhistokemi och FISH måste protokollet först optimeras på hela embryon, och den optimala koncentrationen av antikropp eller sond måste bestämmas empiriskt.Begränsningar av tekniken
Såsom nämnts ovan, är framgången med denna teknik i hög grad beroende av kvaliteten av proteinet och mRNA-detektering. We har skisserat flera förslag på hur protein och mRNA detektion kan förbättras, men i frånvaro av hög kvalitet fluorescerande signal upptäckt, det finns inget sätt experimentet kan fortsätta. Antalet proteinmål som kan analyseras i varje vävnadsprov är begränsad av den spektrala upplösningen hos konfokalmikroskop och av de epitoper av de antikroppar som används. I denna studie kunde vi använda upp till tre epitoper för proteindetektion vid sidan av en DNA-fläck på varje prov 12. Detta protokoll tillåter endast detektion av ett mRNA mål, även om dagens alternativa metoder kan användas för att öka denna till upp till tre mål 14.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder
Den metod som beskrivs här ger en känslig teknik för att upptäcka låg nivå proteinförändringar i hela montering PSM explants. Kvantifiering av denna dynamik ärmöjligt genom att utföra FISH för en känd klock gen i motsvarande kontra explantat. Ett bibliotek av kymographs genereras som kan organiseras under en segmenteklockcykel, med fokus på Spatiotemporal uttryck dynamiken i ett mål av intresse inom denna tidsram. En viktig skillnad i denna teknik framför andra är användningen av beräknings automatisering för att temporärt beställa stora datamängder, som tillåter Spatiotemporal uttryck dynamiken i nya komponenter klock som skall analyseras på ett opartiskt sätt. Till exempel, denna teknik gav en inblick i hur Dll1 och Notch1 proteiner och deras svängningar ges samtidigt regleras över hela PSM. Alternativa metoder I detta sammanhang har också åberopat immunfärgning, men att de inte upptäcka små variationer i Dll1 och Notch1 proteinnivåer i stjärtfenan PSM som var uppenbar med denna metod. Istället visade stabil gradient av uttryck som är starkast i rostral regionen 9 <supp>, 10, 11. Detta kan bero på det faktum att detta protokoll har en längre primär antikropp inkubationstid (3 – 5 dagar, i motsats till natten), som kan krävas för att upptäcka lägre nivåer av protein. Som nivåerna av Dll1 och Notch1 uttryck är relativt höga i rostral PSM, kan detta ha påverkat författarna till bild proverna vid en lägre exponeringsinställning än vad som skulle behövas för att detektera den bakre proteinuttryck. En ytterligare potential diskrepans uppstår från användningen av ofixerade vävnad i studien av Chapman et al. I vilken övergående uttryck av Dll1 och Notch1 i den bakre PSM kan ha varit mindre väl bevarade 9.
Framtida Program eller Vägbeskrivning efter Mastering Technique
När detta protokoll har bemästrat, kan hög genomströmning expressionsanalys utföras för något protein av intresse i PSM.PSM explantat från ett flertal mus kullar kan bearbetas på en gång för att alstra det antal som krävs för analys med hög prov. Även om vi bara har använt embryon av vild typ i dessa studier, är det möjligt att utföra denna analys med användning av genetiskt modifierade embryon i syfte att bedöma betydelsen av en eller flera faktorer på proteinexpressions dynamik. Bortom PSM kan detta protokoll anpassas till andra system som är sammansatta av två kontralaterala halvor och kan användas för att varsamt detektera låg nivå proteinexpressions och oscillerande dynamik. Ett exempel på detta protokoll kan anpassas är studiet av dynamiska proteinuttryck i musen neuralrörsdefekter, eftersom kontra halvor kan genereras och odlas, och Notch aktivitet har visat sig vara både närvarande och viktig för mönstring 15. Vi uppmuntrar andra grupper för att anpassa detta protokoll till andra system och för att ge feedback för framtida förbättringar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av en MRC STUDENT till RAB, en MRC STUDENT till CSLB och WT projektbidrag till JKD (WT089357MA). Arbetet stöddes också av en Välkommen förtroende strategisk award (097.945 / Z / 11 / Z). Vi tackar Dr E. Kremmer för den typ gåva Dll1 antikropp och Dr. O. Pourquie för Lfng RNA-sond.
DMEM-F12 | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 11320033 | |
GlutaMAX™-1 (100X) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 35050 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10270106 | |
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140122 | |
anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^ | BD Pharmingen | 552466 | |
anti-rat polyclonal Dll1 antibody^* | N/A | N/A | |
Lfng intronic anti-sense RNA probe^* | N/A | N/A | |
16% paraformaldehyde | Pierce (ThermoFischer Scientific) | PI28908 | |
Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche (Sigma-Aldrich) | 31158 | |
Phosphate buffered saline (PBS), pH7.4 | Made in house | N/A | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
Normal goat serum (NGS) (heat-treated) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 16210072 | |
Hoechst 33342 | ThermoFischer Scientific | H3570 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 46139 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
Saline-sodium citrate (SSC) | Sigma-Aldrich | 93017 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | |
tRNA | Roche (Sigma-Aldrich) | 101095 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
Tris-buffered saline (TBS) | Made in house | N/A | |
Blocking Buffer Reagent | Roche (Sigma-Aldrich) | 11096176001 | |
anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody | Roche (Sigma-Aldrich) | 11207733910 | |
Tyramide signal amplification (TSA) kit | Perkin Elmer | NEL744001KT | |
*NOTE: The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources. | |||
^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader. |