Vild type Blokering af PCR Kombineret med direkte sekventering som en yderst følsom metode til påvisning af lavfrekvent somatiske mutationer

Summary

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Abstract

Nøjagtig detektion og identifikation af lavfrekvente mutationer kan være problematisk ved vurderingen tilbageværende sygdom efter terapi, screening for nye resistens-mutationer under behandling, eller når patienter har få cirkulerende tumorceller. Vildtype blokering PCR efterfulgt af sekvensanalyse giver høj følsomhed, fleksibilitet og enkelhed som en metode til detektering af disse lavfrekvente mutationer. Ved tilsætning af en specialdesignet låst nukleinsyre oligonukleotid til en ny eller tidligere konstaterede konventionel PCR baseret sekventering assay kan opnås følsomheder på ca. 1 mutant allel i en baggrund af 1000 WT-alleler (1: 1.000). Sekventeringsreaktioner artefakter forbundet med deaminerings- arrangementer almindeligvis findes i formalinfikserede paraffinindlejrede væv kan delvis afhjælpes ved anvendelse af uracil-DNA-glycosylase under ekstraktionstrin. Den optimerede protokol her er specifik til påvisning af MyD88 mutation, men kan tjene som en skabelon til at designe nogetWTB-PCR analyse. Fordele ved WTB-PCR-assayet i forhold til andre almindeligt anvendte assays til påvisning af lavfrekvente mutationer, herunder allelspecifik PCR og kvantitativ realtids-PCR omfatter færre forekomster af falske positiver, større fleksibilitet og lette implementering, og evnen til at detektere både kendte og ukendte mutationer.

Introduction

Sanger-sekventering har traditionelt været guldstandarden inden for testning for både kendte og ukendte somatiske mutationer. En af begrænsningerne ved Sanger-sekventering er dens detektionsgrænse (~ 10 – 20% mutant allel i en baggrund af WT) ^1. Dette niveau af følsomhed er uhensigtsmæssig til påvisning lavt niveau somatiske mutationer, som kan være til stede i prøver fra præmaligne væv eller patienter med få cirkulerende tumorceller, eller når knoglemarv (BM) er fragmentarisk. Dette gør det også vurdere residual sygdom efter terapi eller påvisning nye resistens-mutationer under behandling vanskeligt ved konventionel sekventering alene ^2. Ved at erstatte konventionel PCR med låst nukleinsyre (LNA) -medieret vildtype blokerende PCR (WTB-PCR) i Sanger-sekventering, kan opnås følsomheden af op til 0,1% mutantallel i en baggrund af WT ^{2, 3, 4.} IWTB-PCR, berigelse for mutantalleler opnås via tilsætning af en kort (~ 10-14 NT) blokering (LNA) oligonukleotid, der binder fortrinsvis til WT DNA derved forhindre amplifikation af WT DNA. Mutanten beriget WTB-PCR-produkt kan derefter sekventeret. Ved at blokere WT DNA stedet for at vælge for specifikke mutationer WTB-PCR tillader berigelse af både kendte og ukendte mutationer i ganske små cellefraktioner.

Flere metoder anvendes for tiden til påvisning af mutationer i små celler fraktioner. Dette omfatter allel-specifik PCR amplifikation-mutationssystemanalyse (ARMS), denaturerende højtryksvæskekromatografi (DHPLC), perler, emulsioner, amplifikation, og magnetics (strålede), elektrisk felt-inducerede frigivelse og måling (EFIRM), høj opløsning smeltepunkt og andre. De fleste af disse fremgangsmåder er begrænset af falske positive og evnen til kun at detektere en mutation at assayet var designet til ⁴ </sup>. WTB-PCR, men giver brugeren mulighed for at visualisere sekventering spor, der gør det muligt for påvisning af flere mutation typer og kan støtte i at udelukke falsk positive på grund af artefakter eller deaminerings- begivenheder. Næste generation sekventering (NGS), kan tilbyde et egnet alternativ til konventionel sekventering imidlertid væsentligt større omkostninger, kompleksitet og længere assaytid gøre det en unødvendig mulighed for mange sygdomstilstande typer med få distinkte molekylære markører eller til overvågning af patienter på terapi for nye resistensmutationer. Endvidere høje falske positive satser, når påvisning varianter med mutante allel frekvenser på mindre end 5% kan udgøre et problem for amplicon-baserede NGS ^{5, 6.}

Her demonstrerer vi stigningen i følsomhed opnås ved WTB-PCR i screening for mutationer i den myeloide differentieringsfaktor 88-genet som beskrevet af Albitar et al. ³ MyD88 mutations er vigtige diagnostiske og prognostiske faktorer i Waldenströms makroglobulinæmi (WM), IgM monoklonal gammopati af ukendt betydning (IgM-MGUS), miltmarginalzonen lymfom (SMZL), og diffust storcellet B-celle lymfom (DLBCL). MyD88 mutationer findes i næsten alle tilfælde af WM og ca. 50% af patienter med Immunoglobulin M (IgM) -secreting MGUS. Contrastingly, er MyD88 mutationer findes i kun 0-6% af patienterne med SMZL og er fraværende i myelomatose ^{7, 8.} Fordi overlappende morfologisk, immunfænotypisk, cytogenetiske og kliniske karakteristika mellem WM og SMZL eller IgM-myelomatose kan ofte komplicere differentierede diagnoser, kan tilstedeværelsen af en MyD88 mutation tjene som en nyttig identificere faktor ^9. MyD88 mutationer er også blevet forbundet med større sygdomsbyrde hos patienter med DLBCL og dårlig samlet overlevelse efter terapi ^7, </sup> ^10. Desuden, fordi MyD88 mutationer hyppigere findes i aktiverede B-celle-lignende (ABC) DLBCL end kimcenter B-celle-lignende (GCB) DLBCL eller primær mediastinal B-celle lymfom (PMBL), kan MyD88 mutation status tjene som en surrogatmarkør for ABC undertype ^{11, 12.}

Den detaljerede protokol billede her tjener som en skabelon, som kan udvikles nye assays eller de fleste eksisterende sekventeringsreaktioner assays kan let tilpasses nøjagtigt at detektere lavfrekvente mutationer i forskellige prøvetyper. Den fremgangsmåde kan også anvendes til overvågning og detektion af resistente mutationer, som kan udvikle sig i tumorer eller endda bakterier, der kan udvikle mens patienterne behandles med målrettet terapi eller antibiotika. Endvidere omhandler den og retsmidler mange af de spørgsmål, der er forbundet med mutation berigelse, især i formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE) væv.

Protocol

Etik Statement: Alle testning af humane prøver blev udført efter at have indhentet Institutional Review Board (IRB) godkendelse. 1. DNA Ekstraktion fra FFPE Tissue, perifert blod, og knoglemarvsaspirat Til knoglemarvstransplantation FFPE væv med DNA FFPE ekstraktionskit Begynde med FFPE væv fra ufarvede objektglas (5 – 10 sektioner ved 5 – 10 um tykkelse). BEMÆRK: Hvis der begynder med væv spåner, bruge 3 – 6 sektioner ved 5 – 10 um tykkelse og spring til tr…

Representative Results

En begrebsmæssig oversigt over WTB-PCR under udstrækning er præsenteret i figur 1. Fordi et enkelt nukleotid mismatch i blokker-DNA hybrid spænder formindsker dets smeltetemperatur (ATm = 20 – 30 ° C), amplifikation af WT allel er blokeret mens mutant template DNA er fri til at fuldføre forlængelsen 17. På denne måde er mutant DNA amplificeret eksponentielt mens WT DNA amplificeres lineært. <p class="jove_content" fo:keep-…

Discussion

Den WTB-PCR analysen beskrevet her anvender en generisk sæt primere med en blokerende oligo designet til at blokere opformering af WT DNA under forlængelse (figur 1). Den WTB-PCR-produkt sekventeres derefter for mutationsanalyse. Anvendeligheden af ​​WTB-PCR / Sanger ligger i dets enkelhed, høj følsomhed og høj kapacitet. Under anvendelse af de retningslinjer, der er beskrevet her, kan de fleste eksisterende Sanger baserede assays simpelthen ændres ved hjælp af tilsætning af et blokerende ol…

Materials

1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Eppendorf	05-402-25
100% alcohol	VWR	89370-084	Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencer	ABI		or equivalent
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foils	GeneMate	T-2451-1	For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit	Life Technologies	4337455	For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 Series	Eppendorf		A-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well plates	Eppendorf	Z606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100mM)	Invitrogen	10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet	Thermo Fisher Scientific	12027	For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute	Sigma	E7023	200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Tools			www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul)	Roche	12032937001	With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus			2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit	Qiagen	180134	Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di Formamide	ABI	4311320	For sequencing.
LNA oligonucleotide	Exiqon	500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing Primer	ABI		5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing Primer	ABI		5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler	Eppendorf	E950030020
Microcentrifuge Model 5430	Eppendorf		FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer	IDT		5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primer	IDT		5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates	GeneMate	T-3107-1
Pipettors			20, 200, 1000 µl
Plate septa, 96 well	ABI	4315933
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304	For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0	ABI	4474978	For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3M, pH 5.2)	Sigma	S7899
Sterile filtered pipette tips			20, 200, 1000 µl
Thermomixer C	Eppendorf	5382000023
Vortex genie	Scientific Industries	SI-0236
Wash reservoir			~1000 ml
Xylene	VWR	89370-088	Histology grade