Wild-blokkering van PCR In combinatie met Direct Sequencing als een zeer gevoelige detectiemethode voor Low-Frequency somatische mutaties
Summary
Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.
Abstract
Nauwkeurige detectie en identificatie van laagfrequente mutaties kan problematisch zijn bij de beoordeling residuele ziekte na therapie screenen op opkomende resistentie mutaties tijdens de therapie, of wanneer patiënten hebben weinig circulerende tumorcellen. Wildtype blokkerende PCR en sequentieanalyse biedt een hoge gevoeligheid, flexibiliteit en eenvoud een methode voor detecteren van deze laagfrequente mutaties. Door een speciaal ontworpen vergrendeld nucleïnezuur oligonucleotide een nieuwe of eerder vastgestelde conventionele PCR sequencing assay kan gevoeligheden van ongeveer 1 mutant allel in een achtergrond van 1000 WT allelen worden bereikt (1: 1000). Sequencing artefacten geassocieerd met deaminering gebeurtenissen die algemeen in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde weefsels kan gedeeltelijk verholpen door het gebruik van uracil DNA glycosylase gedurende extractiestappen. De geoptimaliseerde protocol hier specifiek is voor het detecteren MyD88 mutatie, maar kan als een sjabloon voor elk model te dienenWTB-PCR-bepaling. Eigenschappen WTB-PCR-test op andere gewoonlijk gebruikte bepalingen voor het detecteren van lage frequentie mutaties waaronder allelspecifieke PCR en real-time kwantitatieve PCR onder minder voorkomen van valse positieven, grotere flexibiliteit en gemak van implementatie en het vermogen zowel bekende detecteren en onbekende mutaties.
Introduction
Sanger sequencing is van oudsher de gouden standaard in het testen voor zowel bekende als onbekende somatische mutaties geweest. Een van de beperkingen van Sanger sequentiebepaling is de detectiegrens (~ 10-20% mutant allel in een achtergrond van WT) 1. Dit niveau van gevoeligheid is niet geschikt voor het detecteren van lage somatische mutaties die in de monsters aanwezig kan zijn van premaligne weefsels of patiënten met weinig circulerende tumorcellen, of wanneer beenmerg (BM) is fragmentarisch. Dit maakt het ook de beoordeling van residuele ziekte na de behandeling of het opsporen van opkomende resistentie mutaties tijdens de behandeling bemoeilijkt door alleen 2 conventionele sequencing. Door vervanging van conventionele PCR met gesloten nucleïnezuur (LNA) gemedieerde wildtype blokkerende PCR (WTB-PCR) Sanger sequentiebepaling, gevoeligheden van maximaal 0,1% mutante allel in een achtergrond van WT worden gerealiseerd 2, 3, 4. InWTB-PCR, verrijking van mutante allelen wordt bereikt door de toevoeging van een korte (~ 10-14 NT) blokkeren (LNA) oligonucleotide dat bij voorkeur bindt aan WT DNA waardoor voorkomen amplificatie van WT DNA. De mutant-verrijkte WTB PCR-product kan daarna worden gesequenst. Door het blokkeren WT DNA in plaats van het selecteren op mutaties WTB-PCR maakt verrijking van zowel bekende als onbekende mutaties aanwezig in minieme celfracties.
Meerdere methoden worden momenteel gebruikt voor het detecteren van mutaties in kleine cellen fracties. Dit omvat allelspecifieke PCR-amplificatie-refractaire mutatiesysteem (ARMS), denaturerende vloeistofchromatografie (DHPLC), korrels, emulsies, amplificatie en magnetisme (stralend), elektrisch veld geïnduceerde afgifte en meting (Efirm), hoge resolutie smeltpunt en anderen. Echter, de meeste van deze methoden zijn beperkt door vals-positieven en de mogelijkheid om slechts één mutatie dat de test is ontworpen voor 4 sporen </sup>. WTB-PCR, echter, kan de gebruiker sequencing sporen waarbij de detectie van verschillende types mutaties mogelijk maakt en kan helpen bij het uitsluiten van vals positieven als gevolg van artefacten of deaminering te visualiseren. Nieuwe generatie sequencing (NGS) kan een geschikt alternatief voor conventionele sequencing bieden echter aanzienlijk hogere kosten, complexiteit en langere analysetijd maken het onnodig optie voor veel soorten ziekte met enkele verschillende moleculaire merkers of controle van patiënten therapie voor opkomende resistentie mutaties. Verder hoge vals positieven bij het detecteren van varianten met gemuteerde allel een frequentie van minder dan 5% kan problemen opleveren voor amplicon gebaseerde NGS 5, 6.
Hier laten we zien de toename van de gevoeligheid verkregen door WTB-PCR screenen op mutaties in de myeloïde differentiatie factor 88 gen zoals beschreven door Albitar et al. 3 MyD88 mutations zijn belangrijke diagnostische en prognostische factoren in Waldenström Macroglobulinemia (WM), IgM monoclonale gammopathie van onbekende betekenis (IgM-MGUS), milt marginale zone lymfoom (SMZL) en diffuus grootcellig B-cellymfoom (DLBCL). MyD88 mutaties gevonden in bijna alle gevallen van WM en ongeveer 50% van de patiënten met immunoglobuline M (IgM) -secreting MGUS. Daartegenover zijn MyD88 mutaties gevonden in slechts 0-6% van de patiënten met SMZL en afwezig zijn bij multipel myeloom 7, 8. Omdat overlappende morfologische, immuunfenotypische, cytogenetische en klinische kenmerken tussen WM en SMZL of IgM-multiple myeloom vaak bemoeilijken differentiaaldiagnoses kan de aanwezigheid van een mutatie MyD88 een nuttig identificeren factor 9. MyD88 mutaties zijn ook geassocieerd met een grotere ziektelast bij patiënten met DLBCL en slechte algemene overleving na behandeling 7, </sup> 10. Bovendien, omdat MyD88 mutaties voorkomen bij geactiveerde B-cel-achtige (ABC) DLBCL dan kiemcentrum B-cel-achtige (GCB) DLBCL of primaire mediastinale B-cellymfoom (PMBL) kan MyD88 mutatiestatus als dienst surrogaat marker voor de ABC-subtype 11, 12.
De gedetailleerde protocol die hier als een matrijs waaruit nieuwe assays kunnen worden ontwikkeld en de meeste bestaande sequentie bepalingen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan laagfrequente mutaties in diverse soorten monsters nauwkeurig te detecteren. De benadering kan ook worden gebruikt voor het bewaken en detecteren van resistente mutaties die kunnen ontwikkelen tumoren of zelfs bacteriën die kan optreden terwijl patiënten behandeld met gerichte therapie of antibiotica. Verder behandelt het en rechtsmiddelen veel van de problemen in verband met mutatie verrijking, met name in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) weefsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
De WTB-PCR-test beschreven maakt gebruik van een generieke reeks primers met een blokkerende oligo ontworpen om amplificatie van WT DNA blokkeren tijdens verlenging (Figuur 1). De WTB-PCR-product wordt vervolgens gesequenced voor mutatie-analyse. De bruikbaarheid van WTB-PCR / Sanger ligt in de eenvoud, hoge gevoeligheid en hoge doorvoer. Met de hier beschreven richtlijnen kunnen de meeste bestaande Sanger gebaseerde testen eenvoudig gemodificeerd worden door de toevoeging van een blokkerend oligonucleo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| 1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
| 3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
| Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
| Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
| dNTPs (100mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
| Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul) | Roche | 12032937001 | With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
| Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
| GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
| M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes) | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1000 µl | ||
| Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
| Slide basket | |||
| Sodium Acetate (3M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1000 µl | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash reservoir | ~1000 ml | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |
Referências
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
- Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
- Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
- Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
- Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).
- Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström’s macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
- Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
- Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
- Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
- Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
- Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
- Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Applied Biosystems. . User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
- Applied Biosystems. . User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
- Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
- Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
- Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
- Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
- Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
- Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
- Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
- Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
- Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
- Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
- Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716 (2015).
