Summary

와일드 형은 PCR은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹

Published: March 29, 2017
doi:

Summary

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Abstract

정확한 탐지 및 저주파 돌연변이의 식별은 치료 중 내성 돌연변이 신흥 심사, 치료 후 잔여 질병을 평가할 때 문제가 될, 또는 수의 환자가 몇 순환 종양 세포가있을 때. 서열 분석 하였다 PCR 차단 야생형 이러한 저주파 변이를 검출하는 방법으로 고감도, 유연성 및 단순성을 제공한다. 신설하거나 이전에 종래의 PCR 계 서열 분석에 핵산 올리고 뉴클레오티드 로크 설계 정의를 첨가함으로써, 1000 WT 대립 유전자의 배경에서 약 1 돌연변이 대립 유전자의 민감도 (1,000 1)를 실현할 수있다. 탈 아미 노화 이벤트와 연관된 시퀀싱 아티팩트 일반적 부분적 추출 단계 동안 우라실 DNA 글리코의 사용에 의해 해결 될 수 포르말린 고정 파라핀 조직에서 발견. 최적화 된 프로토콜은 여기에서 MyD88 돌연변이를 검출하기위한 특정이지만, 어떤을 설계하는 템플릿 역할을 할 수 있습니다WTB-PCR 분석. PCR 및 실시간 정량 PCR 가양 적게 발생, 유연성 및 구현의 용이성을 포함 특정 대립 유전자를 포함하여 낮은 주파수 변이의 검출에 대한 기타 일반적으로 사용되는 분석을 통해 WTB-PCR 분석의 장점, 둘 다 알려진 감지 할 수있는 능력 알 수없는 돌연변이.

Introduction

생거 시퀀싱은 전통적으로 알려진 알 수없는 체세포 돌연변이 시험에서 황금 표준되었습니다. 생거 시퀀싱의 한계 중 하나는 검출 한계 인 (~ 10 – WT의 배경에 20 % 돌연변이 대립 유전자 1). 감도 수준은 몇 순환 종양 세포 또는 골수 (BM)이 고르지 때와 암성 조직 또는 환자 샘플에 존재할 수있는 낮은 수준의 체세포 돌연변이를 검출하기위한 부적절한. 이것은 또한 치료 후 잔여 질병을 평가 또는 혼자 기존의 염기 서열에 의해 어려운 치료 중에 새로운 저항 변이를 감지한다. 잠긴 핵산 (LNA)와 종래의 PCR 대체함으로써 생거 시퀀싱에 PCR (WTB-PCR)을 차단 야생형를 매개 성, WT의 배경 최대 0.1 % 돌연변이 대립 유전자의 감도는 2, 3, 4를 달성 할 수있다. 에서WT WT DNA의 DNA 증폭 방지하여 우선적으로 결합 – (NT 14 ~ 10) 차단 (LNA) 올리고 WTB-PCR은, 돌연변이 대립 유전자 농축 짧은의 첨가를 통해 달성된다. 돌연변이 풍부한 WTB-PCR 제품은 다음 순서가 될 수있다. WT DNA를 차단하기보다는 특정 돌연변이 선택 WTB-PCR은 분 세포 분획에 존재하는 알려진 알려지지 돌연변이 농축을 허용한다.

여러 방법이 현재 작은 세포 분획에 돌연변이를 검출하기 위해 사용된다. 이는 고성능 액체 크로마토 그래피 (DHPLC), 비드, 에멀젼, 증폭, 및 마그네틱들 (빛나는), 전계 유도 방출 측정 (EFIRM) 변성 대립 유전자 특이 적 PCR 증폭 불응 돌연변이 시스템 (ARMS), 높은 해상도를 포함 녹는 점 등이있다. 그러나, 이러한 방법의 대부분은 가양 만 분석은 4 설계된 하나의 돌연변이를 검출 할 수있는 능력에 의해 제한된다 </> SUP. WTB-PCR은, 그러나, 여러 돌연변이 유형의 검출을 가능하게하고 유물 또는 탈 아미노 이벤트로 인한 오탐 (false positive)을 배제 도움이 될 수 시퀀싱 흔적을 시각화 할 수있게합니다. 차세대 시퀀싱 (NGS)이 기존의 시퀀싱에 적합한 대안을 제공 할 수 있습니다, 그러나, 실질적으로 더 큰 비용, 복잡성, 긴 분석 시간은 그것을 몇 가지 서로 다른 분자 마커 많은 질병 유형 또는 부상에 대한 치료를 환자 모니터링을위한 불필요한 옵션을 렌더링 저항 돌연변이. 5 % 미만의 변이 대립 유전자 빈도와 또 높은 탐지율이 검출 변이체 6 앰플 리콘 기반 NGS 5 문제를 제기 할 수있다.

여기에서는 Albitar 등에 의해 기술 된 바와 같이 골수 분화 인자 88 유전자의 돌연변이에 대해 스크리닝 WTB-PCR에 의해 달성 감도의 증가를 보여준다. 3에서 MyD88의 mutatioNS는 발덴 스트롬 마크로 글로불린 혈증 (WM) 알 수없는 의미 (IgM의-MGUS)의, IgM의 단일 클론 감마 병증, 비장 한계 영역 림프종 (SMZL)에서 중요한 진단 및 예후 인자, 그리고 큰 B 세포 림프종 (DLBCL)을 확산. 에서 MyD88 돌연변이는 WM의 거의 모든 경우와 면역 글로불린 M (IgM의) MGUS를 -secreting 환자의 약 50 %에서 발견된다. 이에 대해서,에서 MyD88 돌연변이는 SMZL 환자의 0 내지 6 %에서 발견 다발성 골수종 7, 8 결석된다. 겹치는 형태 학적, immunophenotypic, 염색체 및 WM 및 SMZL 또는 종종 감별 진단을 복잡하게 할 수-IgM의 다발성 골수종 사이의 임상 적 특성 때문에하는 돌연변이에서 MyD88의 존재하에 유용한 식별 9 인자로서 작용할 수있다. 에서 MyD88 돌연변이 또한, 치료 (7) 다음 DLBCL와 가난한 전체 생존 환자에서 더 큰 질병 부담과 관련이있다 </SUP> 10. 또한에서 MyD88 돌연변이가 자주보다 활성화 된 B 세포 형 (ABC) DLBCL에서 발견되기 때문에 B가 셀 형상 (GCB) DLBCL 또는 기본 종격동 B 세포 림프종 (PMBL)에서 MyD88 돌연변이 상태가로서 작용할 수 배 중심 ABC 방송의 아형 (11), (12)에 대한 대리 마커.

여기에 제공된 상세한 프로토콜은 새로운 분석법이 개발 될 수 있거나 대부분의 기존 서열 분석을 용이하게 정확하게 다양한 샘플 종류 저주파 돌연변이를 검출하도록 구성 될 수있는 주형으로 작용한다. 이 접근법은 또한 모니터링하거나 종양 환자가 치료 표적 항생제로 처리되는 동안 생길 수 심지어 박테리아 개발할 수 내성 돌연변이를 검출하기 위해 사용될 수있다. 또한, 주소, 특히 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 조직에 돌연변이 농축과 관련된 많은 문제 구제.

Protocol

윤리 성명서 : 인간의 모든 샘플 테스트는 임상 시험 심사위원회 (IRB)의 승인을 얻은 후 시행 하였다. 1. FFPE 조직에서 DNA 추출, 말초 혈액 및 골수 대기음 DNA FFPE 추출 키트 골수 FFPE 조직에 대한 흠 슬라이드에서 FFPE 조직으로 시작 (5-5에서 10 절 – 10 μm의 두께). 참고 : 조직 부스러기 시작, 3 개를 사용하는 경우 – 5에서 6 섹션 – 10 μm의 두께와 1.1.6 단계로 건?…

Representative Results

확장시 WTB-PCR의 개념적 개관도 1에 제시된다. 블로커-DNA 하이브리드의 단일 염기 미스 매치가 크게의 용융 온도 감소하므로 (ΔT의 m = 20 – 30 °의 C)에서, WT 대립 유전자의 증폭을 돌연변이 주형 DNA는 확장자 (17)을 완료 할 수없는 상태에서 차단된다. WT 선형 DNA 증폭 동안 이러한 방식으로, 돌연변이 DNA를 기하 급수적으로 증폭된다. <…

Discussion

여기에 설명 된 WTB-PCR 분석은 신장 (도 1) 동안 WT에 DNA의 증폭을 차단하기위한 차단 올리고 프라이머와 일반 세트를 사용한다. WTB-PCR 생성물은 돌연변이 염기 서열을 분석한다. WTB-PCR / 생어의 유틸리티는 단순, 높은 감도 및 높은 처리량에있다. 여기에 설명 된 지침을 사용하여, 대부분의 기존 생어 기반 분석은 단순히 크게 감도를 증가시키기 차단 올리고 뉴클레오티드의 추가를 통해…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have no acknowledgements.

Materials

1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes Eppendorf 05-402-25
100% alcohol VWR 89370-084 Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencer ABI or equivalent
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foils GeneMate T-2451-1 For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit Life Technologies 4337455 For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 Series Eppendorf A-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well plates Eppendorf Z606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100mM) Invitrogen 10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet Thermo Fisher Scientific 12027 For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute  Sigma E7023 200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Tools www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul) Roche 12032937001 With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 
Gel electrophoresis apparatus 2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit  Qiagen 180134 Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di Formamide ABI 4311320 For sequencing.
LNA oligonucleotide Exiqon 500100 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing Primer ABI 5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing Primer ABI 5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler Eppendorf E950030020
Microcentrifuge Model 5430 Eppendorf FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer IDT 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primer IDT 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates GeneMate T-3107-1
Pipettors 20, 200, 1000 µl
Plate septa, 96 well ABI 4315933
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen 51304 For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0 ABI 4474978 For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3M, pH 5.2)  Sigma S7899
Sterile filtered pipette tips  20, 200, 1000 µl
Thermomixer C  Eppendorf 5382000023
Vortex genie Scientific Industries SI-0236
Wash reservoir ~1000 ml
Xylene VWR 89370-088 Histology grade

Referências

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  2. Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
  3. Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
  4. Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
  5. Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
  6. Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).
  7. Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström’s macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
  8. Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
  9. Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
  10. Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
  11. Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
  12. Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
  13. Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  15. Applied Biosystems. . User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
  16. Applied Biosystems. . User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
  17. Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
  18. Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
  19. Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
  20. Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
  21. Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
  22. Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
  23. Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
  24. Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
  25. Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
  26. Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
  27. Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
  28. Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716 (2015).

Play Video

Citar este artigo
Albitar, A. Z., Ma, W., Albitar, M. Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations. J. Vis. Exp. (121), e55130, doi:10.3791/55130 (2017).

View Video