De tipo selvagem Bloqueio de PCR combinada com sequenciação directa como um método altamente sensível para a detecção de Baixa Frequência mutações somáticas

Summary

A PCR de bloqueio do tipo selvagem seguida de sequenciamento direto oferece um método altamente sensível de detecção de mutações somáticas de baixa frequência em uma variedade de tipos de amostra.

Abstract

A detecção precisa e identificação de mutações de baixa frequência pode ser problemática quando se avalia doença residual após terapia, o rastreio de mutações de resistência emergente durante a terapia, ou quando os pacientes têm poucas células tumorais circulantes. De tipo selvagem bloqueio de PCR seguido por análise de sequenciação oferece alta sensibilidade, flexibilidade e simplicidade como uma metodologia para detectar essas mutações de baixa frequência. Ao adicionar um projetado bloqueado oligonucleótido ácido nucleico para um ensaio de sequenciação baseada em PCR convencional novo ou previamente estabelecida, sensibilidades de aproximadamente um alelo mutante de um fundo de 1.000 alelos WT pode ser conseguida (1: 1000). artefactos de sequenciação associados com eventos de desaminação comumente encontrados em tecidos embebidos em parafina fixados com formalina pode ser parcialmente remediada pela utilização de glicosilase de uracilo de ADN durante os passos de extracção. O protocolo optimizado aqui é específico para a detecção de mutação MyD88, mas pode servir como um modelo para conceber qualquerensaio WTB-PCR. As vantagens do ensaio de WTB-PCR em relação a outros ensaios vulgarmente utilizados para a detecção de mutações de baixa frequência, incluindo alelo específico PCR e PCR em tempo real quantitativo incluem menos ocorrências de falsos positivos, maior flexibilidade e facilidade de aplicação, e a capacidade para detectar tanto conhecida e mutações desconhecidas.

Introduction

Sanger de sequenciação tem sido, tradicionalmente, o padrão de ouro em ambos os testes para mutações somáticas conhecidos e desconhecidos. Uma das limitações de Sanger de sequenciação é o seu limite de detecção (~ 10 - 20% alelo mutante em um fundo de WT) ^1. Este nível de sensibilidade é inadequado para a detecção de mutações somáticas de baixo nível, que podem estar presentes em amostras a partir de tecidos pré-malignas ou doentes com algumas células tumorais em circulação, ou quando a medula óssea (BM) é irregular. Isto também faz com que a avaliação de doença residual após terapia ou detecção de mutações resistentes emergentes durante a ter....

Protocol

Declaração de Ética: Todos os testes de amostras humanas foi realizada após a obtenção Institutional Review Board aprovação (IRB).

1. Extracção de DNA a partir de FFPE tecido, sangue periférico, medula óssea e Aspirar

1. Para osso tecido FFPE medula com o kit de extracção de ADN FFPE
   1. Comece com o tecido FFPE de lâminas não coradas (5 - 10 em secções de 5 - 10? M de espessura).
      NOTA: Se início com aparas de tecido, usar 3 - 6 secções de 5 - 10? M de espessura e avance para o passo 1.1.6.
   2. Colocar as lâminas em um carrinho deslizante e preparar quatro reservatórios de lavagem (duas por xileno e duas para 100....

Results

Uma visão geral conceitual de WTB-PCR durante a extensão é apresentado na Figura 1. Uma vez que um único nucleótido mal emparelhado o híbrido ADN-bloqueador diminui consideravelmente a sua temperatura de fus (? T _m = 20 - 30 ° C), a amplificação do alelo WT é bloqueado enquanto ADN molde mutante é livre para completar a extensão ^17. Neste modo, o DNA mutante é amplificada exponencialmente, enquanto ADN WT é amplificado linearmente.

.......

Discussion

O ensaio WTB-PCR descrita aqui utiliza um conjunto genérico de iniciadores com um oligo de bloqueio concebido para bloquear a amplificação de ADN WT durante a extensão (Figura 1). O produto WTB-PCR é, em seguida, sequenciados para análise mutacional. O utilitário de WTB-PCR / Sanger reside na sua simplicidade, de alta sensibilidade, e de alto rendimento. Usando as diretrizes descritas aqui, a maioria dos ensaios baseados em Sanger existentes podem ser simplesmente modificadas por meio da adição de um ol.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de microcentrífuga Safe-Lock de 1,5 ou 2 mL	Eppendorf	05-402-25
Álcool 100%	VWR	89370-084	Grau de histologia; 91,5% Etanol, 5% Álcool isopropílico, 4,5% Álcool metílico
3730XL sequenciador	ABI		ou equivalente
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Para purificação de PCR de esferas magnéticas
Alumínio folhas de vedação	GeneMate	T-2451-1	Para PCR e armazenamento a frio
BigDye Terminator v3.1 Kit de sequenciamento de ciclo	Life Technologies	4337455	Para sequenciamento bidirecional. Com 5x Centrífuga de Tampão de Sequenciamento
Série 5804	Eppendorf		A-2-DWP rotor (para placa PCR)
Placa fria para placas de 96 poços	Eppendorf	Z606634
DNAse, livre de RNAse, água
dNTPs (100 mM)	Invitrogen	10297-117
DynaMag-96 Ímã de Saia Lateral	Thermo Fisher Scientific	12027	Para uso em purificação de PCR.
Etanol Absoluto	Sigma	E7023	200 provas, para biologia molecular
Exiqon website Oligo Tools			www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polimerase (5 U/µ L)	Roche	12032937001	Com tampão de reação PCR concentrado 10x, com 20 mM MgCl2
aparelho de eletroforese			gel de agarose
2% GeneRead DNA FFPE extraction Kit	Qiagen	180134	Contém uracil DNA glicosilase necessário para reduzir artefatos de sequenciamento
Hi-Di Formamida	ABI	4311320	Para sequenciamento.
Oligonucleotídeo LNA	Exiqon	500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = bases LNA)
M13-F Sequenciamento Primer	ABI		5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequenciamento	Primer ABI		5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler	Eppendorf	E950030020
Microcentrífuga Modelo 5430	Rotor Eppendorf		FA-45-30-11 (para tubos de microcentrífuga de 1,5/2 mL)
Espectrofotômetro NanoDrop 2000	Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer	IDT		5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR primer reverso	IDT		5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR placas	GeneMate	T-3107-1
Pipettors			20, 200, 1,000 µ
L Septa de placa, 96 poços	ABI	4315933
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304	Para aspirado de BM e sangue periférico
SeqScape Sortware v3.0	ABI	4474978	Para análise de sequenciamento
Cesta
Acetato de Sódio (3 M, pH 5.2)	Ponteiras
			L
Termomixer C	Eppendorf	5382000023
Vortex genie	Scientific Industries	SI-0236
Reservatório			~ 1.000 mL
Xileno	VWR	89370-088	Grau de histologia