Vildtyp Blockering PCR kombination med direkt sekvensering som en mycket känslig metod för detektion av lågfrekventa somatiska mutationer

Summary

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Abstract

Noggrann detektering och identifiering av lågfrekventa mutationer kan vara problematiskt vid bedömningen kvarvarande sjukdom efter terapi, screening för nya resistensmutationer under terapi, eller när patienter har några cirkulerande tumörceller. Vildtyp blockerande PCR följt av sekvensanalys erbjuder hög känslighet, flexibilitet och enkelhet som en metod för att upptäcka dessa lågfrekventa mutationer. Genom att lägga till en specialdesignad låst nukleinsyra oligonukleotid till en ny eller tidigare fastställts konventionell PCR-baserad sekvense analys kan känslig approximativt en mutant allel i en bakgrund av 1000 WT alleler uppnås (1: 1000). Sekvense artefakter associerade med deaminering händelser förekommer allmänt i formalinfixerade paraffininbäddade vävnader kan delvis åtgärdas genom användning av uracil-DNA-glykosylas under extraktionssteg. Den optimerade protokollet här är specifikt för detektion MyD88 mutation, men kan fungera som en mall för att utforma någonWTB-PCR-analys. Fördelar med WTB-PCR-analysen jämfört med andra vanligen använda analyser för detektering av lågfrekventa mutationer, inklusive allelspecifik PCR och kvantitativ realtids-PCR inkluderar färre förekomster av falska positiva, större flexibilitet och enkel implementering, och förmågan att detektera både kända och okända mutationer.

Introduction

Sanger-sekvensering har traditionellt varit guldmyntfoten i tester för både kända och okända somatiska mutationer. En av begränsningarna av Sanger-sekvensering är dess detektionsgräns (~ 10 – 20% mutant allel i en bakgrund av WT) ^1. Denna nivå av känslighet är olämpligt för detektering av somatiska mutationer på låg nivå som kan vara närvarande i prover från premaligna vävnader eller patienter med få cirkulerande tumörceller, eller när benmärg (BM) är bristfällig. Detta gör också att pröva återstående sjukdom efter terapi eller detektering emerging resistensmutationer under terapi svårt genom konventionell sekvensering enbart ^två. Genom att ersätta konventionell PCR med låst nukleinsyra (LNA) -medierad vildtyp blockerande PCR (WTB-PCR) i Sånger-sekvensering, känsligheter för upp till 0,1% mutanta allelen i en bakgrund av WT kan uppnås ^{2, 3, 4.} IWTB-PCR, anrikning för mutanta alleler uppnås via tillsatsen av en kort (~ 10-14 NT) blockering (LNA) oligonukleotid som företrädesvis binder till WT-DNA för att därigenom förhindra amplifiering av WT-DNA. Mutanten anrikade WTB-PCR-produkten kan sedan sekvenseras. Genom att blockera WT-DNA snarare än att välja för specifika mutationer WTB-PCR medger anrikning av både kända och okända mutationer som förekommer i små fraktioner cell.

Flera metoder används för närvarande för att detektera mutationer i små celler fraktioner. Detta inkluderar allel-specifik PCR, amplifiering-Refractory Mutation System (ARMS), denaturering högprestandavätskekromatografi (DHPLC), pärlor, emulsioner, amplifiering, och magnetiska (fluorescerande), elektriskt fält-inducerad frisättning och mätning (EFIRM), hög upplösning smältpunkt och andra. Dock de flesta av dessa metoder är begränsade av falskt positiva och möjligheten att endast detektera en mutation att analysen var avsedd för ^fyra </sup>. WTB-PCR, men tillåter användaren att visualisera sekvens spår som möjliggör detektion av flera mutationstyper och kan hjälpa till att utesluta falska positiva på grund av artefakter eller deaminering händelser. Nästa generations sekvensering (NGS) kan erbjuda ett lämpligt alternativ till konventionell sekvense emellertid väsentligt högre kostnader, komplexitet, och längre analystid göra det en onödig alternativ för många sjukdomstyper med få distinkta molekylära markörer eller för övervakning av patienter på terapi för emerging resistensmutationer. Dessutom höga falska positiva värden när detekterings varianter med mutanta allel frekvenser mindre än 5% kan utgöra ett problem för amplikon baserade NGS ^{5, 6.}

Här kan vi visa den ökning i känslighet uppnås genom WTB-PCR i screening för mutationer i den myeloida differentieringsfaktor 88 genen såsom beskrivits av Albitar et al. ³ MyD88 mutations är viktiga diagnostiska och prognostiska faktorer i makroglobulinemi (WM), IgM monoklonal gammopati av okänd signifikans (IgM-MGUS), mjälten marginalzon lymfom (SMZL), och diffus stort B-cell-lymfom (DLBCL). MyD88 mutationer återfinns i nästan alla fall av WM och ungefär 50% av patienter med immunglobulin m (IgM) -secreting MGUS. I motsats är MyD88 mutationer som finns i endast 0-6% av patienterna med SMZL och är frånvarande i multipelt myelom ^{7, 8.} Eftersom överlappande morfologisk, immunophenotypic, cytogenetiskt, och kliniska egenskaper mellan WM och SMZL eller IgM-multipelt myelom kan ofta komplicera differentialdiagnoser, kan närvaron av en MyD88 mutation fungera som en användbar identifierande faktor ^9. MyD88 mutationer har också förknippats med större börda sjukdom hos patienter med DLBCL och dålig överlevnad efter terapi ^7, </sup> ^10. Dessutom, eftersom MyD88 mutationer mer ofta i aktiverade B-celliknande (ABC) DLBCL än germinal center B-celliknande (GCB) DLBCL eller primär mediastinala B-cell-lymfom (PMBL), kan MyD88-mutationsstatus tjäna som en surrogatmarkör för ABC subtyp ^{11, 12.}

Den detaljerade protokoll som tillhandahålls här tjänar som en mall från vilken nya analyser kan utvecklas eller de flesta existerande sekvensbestämningsanalyser kan enkelt anpassas att noggrant detektera lågfrekventa mutationer i olika provtyper. Det tillvägagångssätt kan också användas för att övervaka och detektera resistenta mutationer som kan utvecklas i tumörer eller även bakterier som kan utvecklas medan patienter behandlas med riktad terapi eller antibiotika. Dessutom tar det och åtgärder många av de frågor som är förknippade med mutation anrikning, särskilt i formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) vävnad.

Protocol

Etik Statement: All kontroll av mänskliga prover utfördes efter att ha inhämtat Institutional Review Board (IRB) godkännande. 1. DNA-extraktion från FFPE Tissue, perifert blod, och benmärgsaspirat För benmärgs FFPE vävnad med DNA FFPE extraktionssats Börja med FFPE vävnad från ofärgade objektglas (5 – 10 sektioner vid 5 – 10 | im tjocklek). OBS: Om början med vävnads spån, använd 3 – 6 sektioner vid 5 – 10 um tjocklek och vidare till steg 1.1.6. </…

Representative Results

En konceptuell översikt av WTB-PCR under utsträckning presenteras i figur 1. Eftersom en enda nukleotid felparning i blockeraren-DNA-hybriden kraftigt minskar dess smälttemperatur (AT ^ = 20 – 30 ° C), amplifiering av WT-allelen är blockerad medan mutant mall-DNA är fri att fullborda förlängningen 17. På detta sätt, är mutant-DNA amplifieras exponentiellt medan WT DNA amplifieras linjärt. <p class="jove_content" fo:keep-…

Discussion

Den WTB-PCR-analys som beskrivs här använder en generisk uppsättning primrar med en blockerande oligo utformade för att blockera amplifiering av WT-DNA under utsträckning (Figur 1). Den WTB-PCR-produkten sedan sekvens för mutationsanalys. Användbarheten av WTB-PCR / Sanger ligger i dess enkelhet, hög känslighet och hög genomströmning. Med användning av de riktlinjer som beskrivs här, kan de flesta befintliga Sanger baserade analyser enkelt modifieras via tillsats av en blockerande oligonukl…

Materials

1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Eppendorf	05-402-25
100% alcohol	VWR	89370-084	Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencer	ABI		or equivalent
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foils	GeneMate	T-2451-1	For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit	Life Technologies	4337455	For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 Series	Eppendorf		A-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well plates	Eppendorf	Z606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100mM)	Invitrogen	10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet	Thermo Fisher Scientific	12027	For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute	Sigma	E7023	200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Tools			www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul)	Roche	12032937001	With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus			2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit	Qiagen	180134	Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di Formamide	ABI	4311320	For sequencing.
LNA oligonucleotide	Exiqon	500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing Primer	ABI		5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing Primer	ABI		5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler	Eppendorf	E950030020
Microcentrifuge Model 5430	Eppendorf		FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer	IDT		5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primer	IDT		5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates	GeneMate	T-3107-1
Pipettors			20, 200, 1000 µl
Plate septa, 96 well	ABI	4315933
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304	For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0	ABI	4474978	For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3M, pH 5.2)	Sigma	S7899
Sterile filtered pipette tips			20, 200, 1000 µl
Thermomixer C	Eppendorf	5382000023
Vortex genie	Scientific Industries	SI-0236
Wash reservoir			~1000 ml
Xylene	VWR	89370-088	Histology grade