Геном широкий анализ HDAC ингибиторов-опосредованной модуляция микроРНК и мРНК в B клетки вынуждены подвергаются класса переключатель рекомбинации ДНК и дифференцировки клеток плазмы
Summary
Эпигенетических факторов может взаимодействовать с генетической программы модуляции экспрессии генов и регулировать функции B клеток. Объединив в vitro клетки B стимуляции, qRT-PCR и высок объём микроРНК последовательности и мРНК последовательность подходов, мы можем анализировать эпигеномные модуляции экспрессии Мирна и генов в клетки B.
Abstract
Антитело ответы выполняются через несколько критических клетки B внутренние процессы, включая соматических Гипермутационный (ГИМ), класс переключатель рекомбинации ДНК (КСО) и дифференцировки клеток плазмы. В последние годы эпигеномные изменения или факторов, таких как гистона диацетилморфина и микроРНК (интерферирующим), было показано взаимодействовать с B-клетки генетических программах ответов антитела форму, в то время, как было установлено, что дисфункция эпигенетических факторов приводят к аутоантитела ответы. Анализ генома общесистемной Мирна и мРНК выражение в B клеток в ответ на эпигеномный модуляторы имеет важное значение для понимания эпигеномные регулирование B-клеточной функции и антител реакции. Здесь мы демонстрируем протокол для заставить клетки B пройти КСО и плазматических клеток дифференциации, рассматривая эти клетки с Ингибиторы гистоновых деацетилаз (ГДАЦ) (ГУВБ) и анализа выражение mRNA и микроРНК. В этом протоколе, мы непосредственно анализировать дополнительные ДНК — (cDNA кДНК) последовательности, используя последовательность мРНК следующего поколения (мРНК seq) и Мирна seq технологий, картирование секвенирования читает генома и количественная обратная транскрипция (qRT)-PCR. С этими подходами мы определили, что в индуцированной пройти КСО и дифференцировки клеток плазмы клетки B, ИРЧП, эпигенетических регулятор, выборочно модулирует Мирна и мРНК выражения и изменяет КСО и плазматических клеток дифференциации.
Introduction
Эпигенетических меток или факторов, таких как метилирование ДНК, Посттрансляционная изменения гистона и РНК-кодирования (включая микроРНК), модулировать функции клеток путем изменения выражения гена1. Эпигенетические модификации регулировать функции лимфоцитов, например иммуноглобулинов класса переключатель рекомбинации ДНК (КСО), соматические Гипермутационный (ГИМ) и дифференциации в памяти B клетки или клетки плазмы, таким образом модулируя антитела и аутоантитела ответы2,3. КСО и SHM критически требуют активации индуцированной Цитидин Аденозиндеминазный (помощь, кодируются как Aicda), который высоко индуцируется в B клеток в ответ на Т-зависимых и T-независимая антигены4. Класс включен/hypermutated клетки B Далее дифференцироваться в плазматические клетки, которые выделяют большое количество антител в значительной степени зависит от созревания лимфоцитов индуцированного белка моды 1 (Blimp1, кодируются как Prdm1)5. Аномальные эпигеномные изменения в клетках B может привести к аномальным антитела/аутоантител ответы, которые могут привести к аллергической реакции или Аутоиммунная реакция1,4. Понимание как эпигенетических факторов, таких как адаптивной, модулировать клетки B встроенные выражения гена важно не только для разработки вакцины, но важно также выявить механизмы потенциальной реакции ненормальные антител/аутоантител.
Ацетилирование гистона и диацетилморфина являются модификациями остатков лизина на гистоны обычно катализируемой гистона ацетилтрансфераза (ШЛЯПУ) и гистоновых деацетилаз (ГДАЦ). Эти изменения приводят к рост или снижение доступности хроматина и далее разрешить или запретить связывание транскрипционных факторов или белки ДНК и изменением ген выражение5,6, 7 , 8. ингибиторы ГДАЦ (ИРЧП) являются класс соединений, которые вмешиваются с функцией гда. Здесь мы использовали HDI (VPA) для решения регулирование HDAC на профиль выражение внутренней гена B клеток и его механизм.
интерферирующим являются маленькие, -кодирования RNAs приблизительно 18-22 нуклеотидов в длину, создаваемые через несколько этапов. Мирна хост генов являются расшифрованный и формируют шпилька первичной микроРНК (pri адаптивной). Они экспортируются в цитоплазму, где pri адаптивной Далее перерабатывается в адаптивной прекурсоров (pre адаптивной). Наконец зрелый интерферирующим образуются путем расщепления pre адаптивной. интерферирующим признают взаимодополняющие последовательности в 3′ непереведенные регионе их целевой mRNAs6,7. Через post-transcriptional глушителей, адаптивной регулировать клеточную активность, например распространение, дифференциация и апоптоз10,11. Поскольку несколько интерферирующим можно ориентировать же мРНК, а один единый Мирна потенциально может предназначаться нескольких мРНК, важно иметь представление в контексте выражение профиля Мирна понять значение человеческой личности и коллективный эффект адаптивной. интерферирующим было показано, быть вовлечены в развитие B-клеток периферической дифференциации, а также B-клеточной стадии конкретных дифференциации, реакции антитела и аутоиммунные заболевания1,4,9. В 3′ УТР Aicda и Prdm1есть несколько проверенных или прогнозируемых эволюционно сохранены сайтов, которые могут быть объектом интерферирующим8.
Эпигеномные модуляции, включая изменения гистона после транскрипции и адаптивной, отображать шаблон типа клеток и клеток стадии конкретных правил выражение гена9. Здесь мы описываем методы для определения HDI-опосредованной модуляции Мирна и выражение mRNA, КСО и дифференцировки клеток плазмы. К ним относятся протоколы для заставить клетки B пройти КСО и дифференцировки клеток плазмы; для лечения клетки B с ИРЧП; и для анализа Мирна и мРНК выражение qRT-PCR, Мирна seq и мРНК seq10,11,12,8,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол обеспечивает всеобъемлющие подходы к заставить клетки B класса переключения и дифференцировки клеток плазмы; для анализа их воздействия на эпигеномный модуляторы, а именно ИРЧП; и обнаружить влияние ИРЧП на мРНК и Мирна выражение в этих клетках. Большинство из этих подхо?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH грантов Ай 105813 и 079705 Ай (для ПК), Альянс для идентификации целевых исследований волчанки в Lupus Грант ALR 295955 (для ПК) и артрит, Национальный исследовательский фонд исследования Грант (в Гц). TS была поддержана педиатрии медицинский центр, второй Xiangya больницы, Центральный Южный университет, Чанша, Китай, в контексте программы посещения медицинских студент Xiangya-UT школа медицины Сан-Антонио.
Materials
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific – Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
Referências
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
- Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
- White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
- Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
- Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
- Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
- Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).
