Epigenetic कारकों आनुवंशिक कार्यक्रमों के साथ बातचीत करने के लिए जीन अभिव्यक्ति मिलाना और बी सेल समारोह को विनियमित कर सकते हैं । इन विट्रो बी सेल उत्तेजना, qRT-पीसीआर, और उच्च प्रवाह microRNA-अनुक्रम और mRNA अनुक्रम दृष्टिकोण में संयोजन करके, हम बी कोशिकाओं में miRNA और जीन अभिव्यक्ति की epigenetic मॉडुलन का विश्लेषण कर सकते हैं ।
एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं कई महत्वपूर्ण बी सेल के माध्यम से पूरा कर रहे हैं, दैहिक hypermutation सहित आंतरिक प्रक्रियाओं, (SHM), कक्षा स्विच डीएनए पुनर्संयोजन (सीएसआर), और प्लाज्मा सेल भेदभाव । हाल के वर्षों में, epigenetic संशोधनों या कारकों, जैसे citrullinated deacetylation और microRNAs (miRNAs), बी के साथ बातचीत करने के लिए दिखाया गया है-सेल आनुवंशिक कार्यक्रमों के लिए एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं आकार, जबकि epigenetic कारकों की शिथिलता के लिए नेतृत्व पाया गया है autoantibody प्रतिसाद. epigenetic मॉडुलन के जवाब में बी कोशिकाओं में जीनोम चौड़ा miRNA और mRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण बी सेल समारोह और एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के epigenetic विनियमन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. यहां, हम बी कोशिकाओं उत्प्रेरण के लिए सीएसआर और प्लाज्मा सेल भेदभाव से गुजरना के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन, citrullinated deacetylase (HDAC) अवरोधकों (HDIs) के साथ इन बी कोशिकाओं के इलाज, और mRNA और microRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण । इस प्रोटोकॉल में, हम सीधे पूरक डीएनए (सीडीएनए) अगली पीढ़ी के mRNA अनुक्रमण (mRNA-seq) और miRNA-seq प्रौद्योगिकियों, अनुक्रमण का मानचित्रण का उपयोग कर अनुक्रम का विश्लेषण जीनोम के लिए पढ़ता है, और मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन (qRT)-पीसीआर । इन तरीकों के साथ, हम परिभाषित किया है कि, बी कोशिकाओं में सीएसआर और प्लाज्मा सेल भेदभाव, HDI, एक epigenetic नियामक से गुजरना करने के लिए प्रेरित, चुनिंदा miRNA और mRNA अभिव्यक्ति संग्राहक और सीएसआर और प्लाज्मा सेल भेदभाव बदल जाता है ।
Epigenetic मार्क्स या कारकों, जैसे डीएनए मिथाइल, citrullinated posttranslational संशोधनों के रूप में, और गैर कोडिंग RNAs (microRNAs सहित), जीन अभिव्यक्ति में फेरबदल करके सेल समारोह को मिलाना1। Epigenetic संशोधनों को विनियमित बी लिम्फोसाइट समारोह, जैसे immunoglobulin वर्ग स्विच डीएनए पुनर्संयोजन (सीएसआर), दैहिक hypermutation (SHM), और स्मृति बी कोशिकाओं या प्लाज्मा कोशिकाओं को भेदभाव, जिससे एंटीबॉडी और autoantibody संग्राहक प्रतिक्रियाएं2,3। सीएसआर और SHM गंभीर सक्रियण प्रेरित cytidine deaminase (सहायता, Aicdaके रूप में इनकोडिंग) है, जो उच्च बी कोशिकाओं में टी निर्भर और टी स्वतंत्र एंटीजन4के जवाब में प्रेरित है की आवश्यकता होती है । कक्षा बंद/hypermutated बी कोशिकाओं को आगे प्लाज्मा कोशिकाओं में अंतर है, जो एक फैशन में एंटीबॉडी की बड़ी मात्रा में स्रावित बी लिम्फोसाइट-प्रेरित परिपक्वता प्रोटीन 1 (Blimp1, के रूप में इनकोडिंग Prdm1)5पर निर्भर । बी कोशिकाओं में असामान्य epigenetic परिवर्तन ंयायपालिका एंटीबॉडी/autoantibody प्रतिक्रियाओं में परिणाम हो सकता है, जो एलर्जी प्रतिक्रिया या उन्मुक्ति1,4के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. समझ कैसे epigenetic कारकों, जैसे miRNAs, बी सेल मॉडुलन-आंतरिक जीन अभिव्यक्ति न केवल टीके के विकास के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी संभावित असामान्य एंटीबॉडी के तंत्र को प्रकट करने के लिए आवश्यक/autoantibody प्रतिक्रियाओं ।
citrullinated acetylation और deacetylation citrullinated catalyzed (HAT) और citrullinated acetyltransferase (citrullinated) द्वारा आम तौर पर deacetylase प्रोटीन पर lysine अवशेषों में संशोधन कर रहे हैं । ये संशोधन क्रोमेटिन की बढ़ती या घटते पहुंच के लिए नेतृत्व करते है और आगे की अनुमति या प्रतिलेखन कारकों या डीएनए को प्रोटीन और जीन अभिव्यक्ति के परिवर्तन5,6के बंधन को रोकने के, 7 , 8. HDAC अवरोधकों (HDI) यौगिकों के एक वर्ग है कि HDACs के समारोह में हस्तक्षेप कर रहे हैं । यहां, हम HDI (VPA) का इस्तेमाल किया बी कोशिकाओं के आंतरिक जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल पर HDAC के विनियमन और उसके तंत्र पर पता ।
miRNAs छोटे हैं, गैर कोडिंग RNAs लगभग 18 से 22 न्यूक्लियोटाइड लंबाई में है कि कई चरणों के माध्यम से उत्पंन कर रहे हैं । miRNA मेजबान जीन लिखित और कांटा प्राथमिक microRNAs (पंचायती राज-miRNAs) फार्म कर रहे हैं । वे कोशिका, जहां पंचायती राज-miRNAs आगे के अग्रदूत miRNAs (पूर्व miRNAs) में संसाधित कर रहे है निर्यात कर रहे हैं । अंत में, परिपक्व miRNAs पूर्व miRNAs के दरार के माध्यम से गठित कर रहे हैं । miRNAs अपने लक्ष्य mRNAs6,7के ‘ 3 unअनुवादित क्षेत्र के भीतर पूरक दृश्यों को पहचाना । पोस्ट-transcriptional मुंह के माध्यम से, miRNAs जैसे प्रसार, विभेदन, और apoptosis10,11के रूप में सेलुलर गतिविधि को विनियमित । के बाद से एकाधिक miRNAs एक ही mRNA लक्ष्य कर सकते हैं, और एक एकल miRNA संभावित एकाधिक mRNAs लक्ष्य कर सकते हैं, यह महत्वपूर्ण है miRNA अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के एक में संदर्भ को देखने के लिए व्यक्तिगत और miRNAs के सामूहिक प्रभाव के मूल्य को समझते हैं । miRNAs को बी सेल विकास और परिधीय भेदभाव, साथ ही साथ बी-सेल स्टेज-विशिष्ट भेदभाव, एंटीबॉडी प्रतिक्रिया, और उन्मुक्ति1,4,9में शामिल होने के लिए दिखाया गया है । Aicda और Prdm1के 3 ‘ UTR में, वहां रहे है कई मांय या भविष्यवाणी की evolutionarily साइटों है कि miRNAs8द्वारा लक्षित किया जा सकता है संरक्षित ।
Epigenetic मॉडुलन, citrullinated पद-प्रतिलेखन संशोधन और miRNAs सहित, एक सेल-प्रकार और सेल स्टेज-जीन अभिव्यक्ति9के विशिष्ट विनियमन पैटर्न प्रदर्शन. यहाँ, हम miRNA और mRNA अभिव्यक्ति, सीएसआर, और प्लाज्मा सेल भेदभाव के HDI मध्यस्थता मॉडुलन को परिभाषित करने के लिए तरीकों का वर्णन. ये सीएसआर और प्लाज्मा सेल भेदभाव से गुजरना करने के लिए बी कोशिकाओं उत्प्रेरण के लिए प्रोटोकॉल शामिल हैं; HDI के साथ बी कोशिकाओं के इलाज के लिए; और qRT द्वारा miRNA और mRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए-पीसीआर, miRNA-seq, और mRNA-seq10,11,12,8,13।
प्रोटोकॉल सैन एंटोनियो में टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों के पशु देखभाल दिशानिर्देश इस प्रकार है ।
1. सीएसआर के लिए माउस बी क…
यह प्रोटोकॉल बी सेल वर्ग स्विचन और प्लाज्मा सेल भेदभाव प्रेरित करने के लिए व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करता है; epigenetic मॉडुलन, अर्थात् HDI द्वारा उनके प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए; और इन कोशिकाओं में mRNA और miRNA अ?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम NIH अनुदान एअर इंडिया १०५८१३ और ऐ ०७९७०५ (पीसी के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था, एक प्रकार का वृक्ष अनुदान ALR २९५९५५ (पीसी के लिए) में एक प्रकार का वृक्ष अनुसंधान लक्ष्य पहचान के लिए एलायंस, और गठिया राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन अनुसंधान अनुदान (हर्ट्ज के लिए) । टीएस बाल रोग चिकित्सा केंद्र, दूसरा Xiangya अस्पताल, मध्य दक्षिण विश्वविद्यालय, चांगशा, चीन द्वारा समर्थित किया गया था Xiangya के संदर्भ में-यूटी स्कूल ऑफ मेडिसिन सैन एंटोनियो मेडिकल छात्र कार्यक्रम का दौरा ।
C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
FBS | Hyclone | SH300 | |
HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific – Hyclone | SV3007901 | |
β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
Rotor 6M | ELMI | 6M | |
Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
FACSDiva software | BD Biosciences | ||
FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |