MicroRNAs 받 클래스 스위치 DNA 재조합 및 플라즈마 세포 차별화에 B 세포 유도에서 mRNAs의 게놈 넓은 분석의 HDAC 억제제 중재 변조
Summary
후 성적인 요소는 유전자 발현을 조절 하 고 B 세포 기능을 조절 하는 유전자 프로그램으로 작용할 수 있습니다. 결합 하 여 체 외에서 B 세포 자극, qRT-PCR, 및 높은 처리량 예측에 관한 시퀀스 및 mRNA 순서 접근, 우리 B 세포에서 miRNA 및 유전자 표현의 epigenetic 변조를 분석할 수 있습니다.
Abstract
항 체 응답은 신체적인 hypermutation (SHM), 클래스-스위치 DNA 재결합 (CSR), 및 플라즈마 세포 분화를 포함 하 여 몇 가지 중요 한 B 세포-기본 프로세스를 통해 수행 됩니다. 최근 몇 년 동안, 후 성적인 수정 또는 히스톤 deacetylation 및 microRNAs (miRNAs) 같은 요인 보였다 epigenetic 요인의 부전으로 이어질 발견 되었습니다 동안 모양 항 체 반응, B-세포 유전 프로그램 상호 작용 autoantibody 응답입니다. Epigenetic 변조기에 B 세포에 게놈 넓은 miRNA 및 mRNA 표정 분석 하는 것이 B 세포 기능과 항 체 반응의 후 성적인 규정을 이해 하는 데 중요 합니다. CSR 및 플라스마 세포 감 별 법을 B 세포를 유도, 히스톤 deacetylase (HDAC) 억제제 (HDIs)와이 B 세포 치료 및 mRNA와 예측에 관한 식 분석 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜에 직접 보완 DNA (cDNA) 시퀀스를 사용 하 여 다음-세대 mRNA 시퀀싱 (mRNA-seq) 미르-seq 기술과 시퀀싱의 게놈, 그리고 양이 많은 반전 녹음 방송 (qRT)를 읽고 분석-PCR. 이러한 방법으로 우리는 정의 B 세포는 CSR 및 플라스마 세포 감 별 법을 유도, HDI, 후 레 귤 레이 터, 선택적으로 miRNA 및 mRNA 표정 변조 CSR 및 플라즈마 세포 분화를 변경.
Introduction
후 성적인 부호 또는 DNA 메 틸 화, 히스톤 posttranslational 수정, 및 비 코딩 RNAs (microRNAs 포함) 같은 요인 유전자 식1을 변경 하 여 세포 기능을 조절. 후 성적인 수정 B 림프 구 기능, 면역 글로불린 종류 스위치 DNA 재결합 (CSR), 신체적인 hypermutation (SHM), 및 메모리 B 세포 또는 플라스마 세포, 항 체 및 autoantibody 변조 함으로써 차별화 등 규제 응답2,3. CSR과 SHM 비판적으로 높은 T-종속 및 T-독립 항4B 세포에서 유도 된 활성화 유도 cytidine deaminase (원조, Aicda로 인코딩된), 필요 합니다. 클래스-전환/hypermutated B 셀 추가 1 (Blimp1, Prdm1로 인코딩된)5패션 비판적으로 유도 하는 B 림프 구 성숙 단백질에 의존에 항 체의 대량 분 비 플라즈마 세포로 분화. 탈 항 체/autoantibody 반응, 알레르기 반응 또는 면역1,4이어질 수 있는 B 세포에서 비정상적인 epigenetic 변화 될 수 있습니다. 어떻게 후 성적인 요소 이해, miRNAs, 같은 변조 B 세포 내장 유전자 발현은 백신 개발에 대 한 중요 한 뿐만 아니라 그러나 또한 잠재적인 비정상적인 항 체/autoantibody 응답의 메커니즘을 필수적 이다.
Histone acetylation와 deacetylation는 히스톤 단백질 히스톤 acetyltransferase (모자) 및 히스톤 deacetylase (HDAC)에 의해 일반적으로 촉매에 리 진 잔류물의 수정. 이러한 수정 chromatin의 증가 또는 감소 접근으로 이어질 더 허용 또는 녹음 방송 요인 또는 단백질의 바인딩을 DNA와 유전자 식이5,6, 의 변경 방지 7 , 8. HDAC 저 해제 (HDI)는 HDACs의 기능을 방해 하는 화합물의 클래스. 여기, 우리는 B 세포의 본질적인 유전자 식 프로필에와 그것의 메커니즘에 HDAC의 규제를 해결 하기 위해 HDI (VPA)를 사용.
miRNAs는 작은, 비 코딩 RNAs 약 18 ~ 22 뉴클레오티드 길이에서 여러 단계를 통해 생성 되는. miRNA 호스트 유전자 변하게 되 고 머리 핀 기본 microRNAs (pri-miRNAs)를 형성 한다. 그들은 선구자 miRNAs (pre-miRNAs)에 pri miRNAs는 더 처리는 세포질에 수출 된다. 마지막으로, 성숙 miRNAs는 사전 miRNAs의 분열을 통해 형성 된다. miRNAs는 3′ 번역된의 영역 내에 그들의 표적 mRNAs6,7보완 시퀀스를 인식합니다. Post-transcriptional 입을 통해 miRNAs 확산, 감 별 법, apoptosis10,11같은 세포 활동을 조절. 여러 miRNAs 동일한 mRNA를 타겟팅 할 수 있기 때문에 하나 하나의 miRNA 잠재적으로 여러 mRNAs를 타겟팅 할 수 있습니다, 개인의 가치와 miRNAs의 집단 효과 이해 하는 미르 식 프로필의 직접 보기 중요 하다. miRNAs B 세포 개발 및 주변 차별화로 B-세포 단계 특정 분화, 항 체 응답 및 면역1,,49에 포함 될 표시 되었습니다. 에 3′ UTR Aicda 및 Prdm1의 여러 검증 또는 예측 진화론 보존된 사이트 miRNAs8여 대상이 될 수 있다.
히스톤 후 전사 수정 등 miRNAs, epigenetic 변조 유전자 식9의 셀 유형과 셀 단계-특정 규칙 패턴을 표시 합니다. 여기, miRNA 및 mRNA 표현, CSR, 그리고 플라즈마 세포 분화의 HDI 중재 변조를 정의 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 CSR 및 플라즈마 세포 분화;을 B 세포를 유도 대 한 프로토콜을 포함 HDI;와 B 세포를 치료에 대 한 qRT-PCR, 미르-seq, 및 mRNA seq10,11,12,,813miRNA 및 mRNA 표정 분석을 위한.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜 B 셀 클래스 스위칭 및 플라즈마 세포 분화; 유도에 포괄적인 접근을 제공 합니다. epigenetic 변조기, 즉 HDI;에 의해 그들의 영향을 분석 하 그리고이 세포에서 mRNA와 미르 식에 HDI의 효과 검색 합니다. 이러한 방법의 대부분은 또한 인간 B 세포 기능 및 mRNA/miRNA 표정에 epigenetic 요인의 영향을 분석 하 사용할 수 있습니다. QRT-PCR 및 mRNA-seq/미르-seq 접근 또한 HDIs 같은 후 변조기로 치료 하는 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 교부 금 AI 105813 및 인공 지능 079705 (PC)에 의해 지원 되었다, Lupus 연구 대상 식별 Lupus 그랜트 ALR 295955 (PC)에 대 한 얼라이언스와 관절염 국립 연구 재단 연구 부여 (HZ). TS는 의학 샌 안토니오 Xiangya UT 학교 학생 방문 프로그램의 맥락에서 소아과 의료 센터, 두 번째 Xiangya 병원, 중앙 남쪽 대학, 창사, 중국에 의해 지원 되었다.
Materials
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific – Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
Referências
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
- Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
- White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
- Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
- Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
- Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
- Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).
