В Utero Электропорация подходы к изучению возбудимости нейрональных субпопуляциях и Connectivity одноклеточные
Summary
Эта рукопись содержит протоколы , которые используют в внутриутробно электропорации (ИЭГ) , чтобы описать структурную связность нейронов на уровне одной клетки и возбудимости флуоресцентно меченных нейронов. Гистологии используется для характеристики дендритную и аксонов проекции. Запись цельноклеточная при острых срезов используется для исследования возбудимость.
Abstract
Нервная система состоит из огромного диапазона различных типов нейронов. Эти нейронные субпопуляции характеризуются, помимо всего прочего, их различных дендритных морфологией, их специфических форм аксонов соединений и их селективных реакций обжига. Молекулярные и клеточные механизмы, ответственные за эти аспекты дифференциации в процессе развития все еще плохо изучены.
Здесь мы опишем комбинированные протоколы для маркировки и характеризующие структурную связность и возбудимость корковых нейронов. Модификация протокола в маточно электропорации (ИЭГ) позволяет маркировать разреженной популяции нейронов. Это, в свою очередь, позволяет идентифицировать и отслеживать дендритов и аксонов отдельных нейронов, точной характеристики ламинарного расположения аксонов проекций и анализа морфометрического. ИЭГ также может быть использован для изучения изменений в возбудимостидикого типа (WT) или генетически модифицированные нейроны, комбинируя его с записью целых клеток от острых кусочков электропорации мозга. Эти два метода способствуют лучшему пониманию сочетания структурных и функциональных связей и молекулярных механизмов, контролирующих нейронную разнообразие в процессе развития. Эти процессы развития имеют важные последствия для аксонов проводки, функциональное разнообразие нейронов и биологии когнитивных расстройств.
Introduction
Развитие дендритных и аксонального структур является важным аспектом регулирования цепи в нервной системе, в том числе и в коре головного мозга. Он играет важную роль в процессе селективного проводки разнообразных нейронных субпопуляций. Ряд последних отчетов показали, что, в дополнение к связи, молекулярное разнообразие нейронов отражается приобретение весьма специфических режимов стрельбы. Однако механизмы , определяющие возбудимость и связность различных нейрональных подтипов в процессе развития, а также степень их координации, все еще плохо изучены 1, 2.
В естественных условиях убыт- и получить-оф-функции анализа позволяют для изучения взаимосвязи между уровнем экспрессии специфических генов и их влияние в развитии схемы. Внутриутробное электропорации (ИЭГ) представляет собой метод широко используется для изученияфункция представляющего интерес гена в конкретных нейронные популяции и изучить общие закономерности их соединения. Тем не менее, для определения морфологических характеристик аксонов и дендритов в кортикальных слоях в живых мышей, необходимо маркировать нейроны скудно. Рекомбинация система Cre в сочетании с ИЭГ может использоваться, чтобы отметить редкую популяцию нейронов при достаточно низкой плотности для разрешения проекции, излучаемые отдельными клетками определенных корковых пластинками. Этот метод метки достаточное количество нейронов в коре головного мозга , чтобы получить количественные данные после анализа разумных числа электропорации мозга (рисунок 1). Эта рукопись представляет собой метод для такого тонкого анализа связности. Она также представляет собой ту же стратегию, чтобы проанализировать, в отдельных экспериментах, электрические свойства нейронов путем выполнения текущего хомута записи на зеленый флуоресцирующий белок (GFP) -electroporated клетки от острых корковых срезов. Эти протоколы являются универсальными и могут быть применены к изучению возбудимости и связи нейронов WT и трансгенных животных, а также нейронов, в которых потери и выигрыши функции вводятся дополнительные плазмид во время ИЭГ.
Хотя этот протокол описывает электропорации мышей на эмбриональный день (E) 15,5, эта методика может быть выполнена в любом возрасте между E9.5 3 и постнатальный день (P) 2 4. Хотя электропорации на ранних стадиях цели нейроны и предшественники таламуса и глубокие слои коры, поздних стадиях электропорации метки более поверхностных слоев (например, нейроны E15.5 ИЭГ мишени слой II-III). Таким образом, сочетание ИЭГ с морфологическим анализом и электрофизиологии одноклеточного является полезным инструментом, чтобы выяснить молекулярные механизмы, лежащие в основе огромного структурного и функционального разнообразия нейронов в нервной системе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол подробно описывает, как маркировать нейроны соматосенсорной коры у мышей C75BL / 6, с тем, чтобы проанализировать их связь и их возбудимость. Что касается существующих методов, она визуализирует дискриминационные аспекты связи, такие как количество аксонов ветвей на нейрон, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Р. Гутьеррес и А. Моралес за отличную техническую помощь и LA Weiss для редактирования. БГКП финансируется испанский Ministerio де Ciencia е Innovación (MICINN), ИПИ-BES-2012-056011. Эта работа финансировалась за счет гранта от Фонда BBVA и SAF2014-58598-Жин (MINECO) к М. Наваррете и гранта от Фонда Рамона Areces и грантов SAF2014-52119-R и BFU2014-55738-REDT (от MINECO) до М. Ньето.
Materials
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 |
| Scalpel Handle #3 – 12cm | Fine Science Tools | 10003-12 |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 |
| Adson Forceps-Serrated – Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 |
| Hardened Fine Scissors – Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14,5cm | Teleflex | PO143281 |
| Thin curved tips – Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 |
| Mathieu Needle Holder – Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL |
| 9mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 |
| Sutures – Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 |
| Borosilicate glass capillaries (100mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | – |
| Needle 25G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 |
| OCT Compound | Sakura | 4583 |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 |
| Microscope for Fluorescent Imaging – MZ10F | Leica | – |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | – |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | – |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | – |
| Cryostat – CM 1950 | Leica | – |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | – |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 |
| Air Table | Newport | – |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | – |
Referências
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices. J Vis Exp. (81), (2013).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), (2016).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. (31), (2009).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J Vis Exp. (44), (2010).
- Woodworth, M. B., et al. Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers. Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Dev Growth Differ. , (2015).
- Miller, M. Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons. J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).
- Miller, M., Peters, A. Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons. J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).
- Cubelos, B., et al. Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone. Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).
- Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J Vis Exp. (109), (2016).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex. J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
