In Utero électroporation approches pour étudier l'excitabilité des neurones sous - populations et connectivité unicellulaire
Summary
Ce manuscrit fournit des protocoles qui utilisent électroporation in utero (IUE) pour décrire la connectivité structurelle des neurones au niveau d'une seule cellule et l'excitabilité des neurones marqués par fluorescence. L'histologie est utilisé pour caractériser dendritique et projections axonales. enregistrement cellules entières en tranches aiguës est utilisée pour étudier l'excitabilité.
Abstract
Le système nerveux est composé d'une vaste gamme de types de neurones distincts. Ces sous-populations neuronales se caractérisent, entre autres caractéristiques, leurs morphologies dendritiques distinctes, leurs modèles spécifiques de connectivité axonale, et leurs réponses de tir sélectif. Les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de ces aspects de la différenciation au cours du développement sont encore mal compris.
Ici, nous décrivons les protocoles combinés pour l'étiquetage et la caractérisation de la connectivité structurelle et l'excitabilité des neurones corticaux. Modification du protocole électroporation in utero (IUE) permet l'étiquetage d'une faible densité de population de neurones. Ceci, à son tour, permet l'identification et le suivi des dendrites et des axones des neurones individuels, la caractérisation précise de l'emplacement laminaire des projections axonales et analyse morphométrique. IUE peut également être utilisé pour étudier les changements dans l'excitabilitéDe type sauvage (WT) ou neurones génétiquement modifiés en le combinant avec l'enregistrement de cellules entières à partir de tranches aiguës de cerveaux électroporation. Ces deux techniques contribuent à une meilleure compréhension de l'accouplement de la connectivité structurelle et fonctionnelle, ainsi que des mécanismes moléculaires qui contrôlent la diversité des neurones au cours du développement. Ces processus de développement ont des implications importantes sur le câblage axonal, la diversité fonctionnelle des neurones, et la biologie des troubles cognitifs.
Introduction
Le développement de structures dendritiques et axonales est une facette importante de la régulation du circuit dans le système nerveux, y compris dans le cortex cérébral. Elle joue un rôle crucial au cours du câblage sélectif des diverses sous-populations neuronales. Un certain nombre de rapports récents ont montré que, en plus de la connectivité, la diversité moléculaire des neurones se traduit par l'acquisition de modes très spécifiques de tir. Cependant, les mécanismes de détermination de l'excitabilité et de la connectivité des sous – types neuronaux distincts au cours du développement, ainsi que leur degré de coordination, sont encore mal compris 1, 2.
In vivo et déficitaires gain de fonction analyse permettent l'étude de la relation entre le niveau d'expression de gènes spécifiques et de leur influence sur le développement du circuit. In utero électroporation (IUE) est une technique largement utilisée pour étudierla fonction d'un gène d'intérêt dans les populations neuronales spécifiques et d'étudier les tendances générales de leur connectivité. Toutefois, afin de déterminer les caractéristiques morphologiques des axones et des dendrites dans les couches corticales chez les souris vivantes, il est nécessaire d'étiqueter les neurones à faible densité. Un système de recombinaison Cre combinée avec IUE peut être utilisée pour marquer une faible densité de population de neurones à une densité suffisamment faible pour résoudre les projections émises par des cellules individuelles des lamelles corticales identifiés. Cette méthode étiquettes un nombre suffisant de neurones par cortex pour obtenir des données quantitatives , après l'analyse des nombres raisonnables de cerveaux électroporation (Figure 1). Ce manuscrit présente une méthode pour une telle analyse fine de la connectivité. Il présente également une stratégie similaire pour analyser, dans des expériences séparées, les propriétés électriques des neurones en effectuant des enregistrements en cours-clamp sur protéine de fluorescence verte (GFP) -electroporated cellules à partir de tranches corticales aiguës. Ces protocols sont souples et peuvent être appliqués à l'étude de l'excitabilité des neurones et de la connectivité des animaux transgéniques WT et, ainsi que des neurones dans lesquels les pertes et gains de fonction sont introduits par des plasmides supplémentaires au cours de l'IUE.
Bien que ce protocole décrit l'électroporation de souris au jour embryonnaire (E) 15.5, cette technique peut être effectuée à tout âge entre 3 et E9.5 jour postnatal (P) 2 4. Alors que l' électroporation à des stades précoces ciblant les neurones et les précurseurs du thalamus et des couches profondes du cortex, électroporation marques plus tard, au stade des couches les plus superficielles (par exemple, les neurones E15.5 IUE cibles couche II-III). En résumé, la combinaison de IUE avec l'analyse morphologique seule cellule et électrophysiologie est un outil utile pour élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents de la grande diversité structurale et fonctionnelle des neurones dans le système nerveux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit en détail la façon d'étiqueter les neurones du cortex somatosensoriel de C75BL / 6 souris afin d'analyser leur connectivité et leur excitabilité. En ce qui concerne les méthodes existantes, il permet de visualiser les aspects discriminatoires de la connectivité, tels que le nombre de branches axonales par neurone, leur topographie précise, et leur localisation anatomique. En modifiant la position des électrodes, il est possible de cibler d' autres populations de neurones, telles…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à R. Gutiérrez et A. Morales pour leur excellente assistance technique et à Los Angeles Weiss pour l'édition. CGB est financé par le e Espagnol Ministerio de Ciencia Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Ce travail a été financé par une subvention de la Fondation BBVA et SAF2014-58598-JIN (MINECO) à M. Navarrete et par une subvention de la Fondation Ramón Areces et subventions SAF2014-52119-R et BFU2014-55738-REDT (de MINECO) à M. Nieto.
Materials
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 |
| Scalpel Handle #3 – 12cm | Fine Science Tools | 10003-12 |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 |
| Adson Forceps-Serrated – Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 |
| Hardened Fine Scissors – Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14,5cm | Teleflex | PO143281 |
| Thin curved tips – Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 |
| Mathieu Needle Holder – Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL |
| 9mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 |
| Sutures – Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 |
| Borosilicate glass capillaries (100mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | – |
| Needle 25G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 |
| OCT Compound | Sakura | 4583 |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 |
| Microscope for Fluorescent Imaging – MZ10F | Leica | – |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | – |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | – |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | – |
| Cryostat – CM 1950 | Leica | – |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | – |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 |
| Air Table | Newport | – |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | – |
Referências
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