A continuación, se describe la purificación de Legionella pneumophila (L. pneumophila) vesículas de membrana externa (OMV) a partir de cultivos líquidos. Estas vesículas purificadas se usan después para el tratamiento de los macrófagos para analizar su potencial pro-inflamatoria.
Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases.
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays.
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.
Las bacterias pueden secretar factores de virulencia a través de diferentes mecanismos 1. Además de los sistemas de secreción conocidas, las bacterias Gram-negativas pueden intercambiar información y entregar factores de virulencia a través de vesículas de membrana externa (OMV), que son pequeñas, vesículas esferoide 10-300 nm de diámetro y con una estructura de membrana de dos capas. Ellos son secretadas en una variedad de entornos de crecimiento (cultivo líquido, cultivo sólido, y biofilms) y en todas las fases de crecimiento 2, 3. Las OMV son un importante medio de transporte (por ejemplo, para las proteínas, las adhesinas, toxinas y enzimas, así como para el LPS, que se encuentra en la superficie de OMV) 4. La carga intraluminal está protegido de la degradación proteolítica, por lo que es capaz de actuar a largas distancias, y las vesículas se puede encontrar en los fluidos corporales y órganos distantes 5, 6,"xref"> 7, 8. No sólo pueden ser reconocidos y absorbidos por las células eucariotas 9, 10, sino que, además, son capaces de facilitar la unión de las bacterias y su invasión en células huésped 4. Legionella pneumophila (L. pneumophila) es una bacteria Gram-negativa que puede liberar las OMV. En el pulmón humano, infecta principalmente macrófagos alveolares, a pesar de su huésped natural son amebas de agua dulce 11. Una infección de L. pneumophila puede causar la enfermedad del legionario, una forma grave de neumonía 12. Se bloquea la fusión fagosoma-lisosoma en la célula huésped. También recluta a los orgánulos de acogida, mediante el cual un nicho de replicación, la Legionella -Con vacuola (LCV), se forma 13, 14. degradación lisosomal se inhibe no sólo por tra proteínas efectorasnslocation a través del sistema de secreción de tipo IV, pero también por la liberación de las OMV 15.
Se requiere que la purificación de las OMV a partir de cultivos bacterianos para analizar su efecto sobre las células receptoras. Estudios anteriores se centraron en el contenido de proteína de L. pneumophila OMVs y en la influencia de las vesículas en las células epiteliales alveolares 16, pero estudios posteriores con los trasplantes de tejido pulmonar humano demostraron que L. pneumophila OMVs son absorbidos por los macrófagos alveolares 17.
A medida que los patrones actuales de OMV asociados a patógenos (PAMPs moleculares) y otros antígenos bacterianos, que podrían tener un impacto en la infección de células eucariotas y modular la respuesta inmune del huésped 18. L. pneumophila las OMV se fusionan rápidamente con las membranas de la célula huésped y, por otra parte, activan la membranosa TLR2 19. Como se sabe que L. pneumophila las OMV estimulan los macrófagos y las células epiteliales de una manera pro-inflamatoria 16, 17, analizamos el impacto de las OMV en el proceso de infección en los macrófagos humanos y murinos.
A continuación, se describe un protocolo para el cultivo de L. pneumophila en cultivo líquido para aislar los OMV secretadas por ultracentrifugación diferencial y para evaluar el impacto de las vesículas en las células huésped eucariotas, ya sea directamente o después de una infección.
Las OMV de patógenos bacterianos y el impacto de estas vesículas de membrana de sus células diana están actualmente siendo estudiados intensamente. Por ejemplo, Clostridium perfringens -derivado OMVs inducen la secreción de citoquinas en los macrófagos, los linfocitos B pueden ser activadas por las OMV de Borrelia burgdorferi, y Helicobacter pylori -released vesículas de membrana pueden actuar sobre las células epiteliales gástricas 21, 22, 23. L. pneumophila, un patógeno intracelular que puede inducir una forma grave de neumonía atípica, también libera las OMV que son capaces de activar las células y macrófagos 16, 19 epiteliales del pulmón. A continuación, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento a pequeña escala de L. pneumophila las OMV de cultivo líquido para estudiar el papel potencial de las OMV en la neumonía. Es fundamental para trabajar bajo Condit estériliones y descartar la contaminación de otras bacterias con el fin de obtener una L. pneumophila pura -derivado preparación de OMV. El aislamiento de las OMV incluye una etapa de filtración a través de poros de 0,22 micras con el fin de evitar la contaminación de la pastilla OMV obtenido con L. pneumophila, a pesar de que esto reduce el rendimiento de OMV, ya que los más grandes las OMV se pierden por esta etapa de filtración.
Por otra parte, hemos probado la respuesta de los macrófagos humanos y murinos a esas vesículas aisladas y células infectadas con L. pneumophila para aproximarse más de cerca la situación en la neumonía por Legionella, donde las OMV son liberados dentro de la LCV por bacterias extracelulares 15. Las dosis empleadas OMV se han estimado de acuerdo con la cantidad libre de OMV en una infección in vitro de macrófagos humanos después de 24 h de incubación (descrito en la referencia 20). Para la estimulación de otras células receptoras o pt experimentos in vivo,OMV otras dosis pueden ser necesarios y deben ser establecidos. El análisis del efecto de L. pneumophila VME representa un avance con el protocolo descrito por Jager y Steinert 24.
Aquí, PMA-diferencian las células THP-1 sirven como modelo para los macrófagos alveolares debido a la limitada disponibilidad de material humano primario. La adición de PMA diferencia los monocitos las células THP-1 en las células como los macrófagos-25. Además, son una línea celular modelo bien conocido para L. pneumophila estudia 26. Además de esta línea celular de monocitos humanos, se usan células mBMDM. mBMDM son ampliamente aceptados para el estudio de los efectos de L. pneumophila 27, 28, 29. La posibilidad de utilizar nocauts genéticos de diferentes TLRs u otras proteínas en una herramienta valiosa para el estudio de los efectos de OMV hacer. En Order para disminuir la cantidad de ratones por experimento, mBMDM se utilizan en lugar de los macrófagos alveolares debido a las limitaciones de los macrófagos. experimentos clave podrían requerir los macrófagos alveolares para la validación.
Además del protocolo descrito en el presente documento de ultracentrifugación para purificar las OMV, es posible llevar a cabo una centrifugación en gradiente de densidad, que se incluye en el protocolo por Chutkan et al. 30. Esto podría mejorar la pureza de la preparación de OMV obtenido y reducir la cantidad de agregados co-purificado de proteínas, flagelina, y LPS. La pureza de la preparación de OMV obtenido puede ser analizado por microscopía electrónica de transmisión o por análisis de seguimiento de nanopartículas como un paso adicional en el control de calidad. Esto puede proporcionar un medio adicional de cuantificación, más allá del procedimiento de medición de proteínas que aquí se presenta. Opcionalmente, la concentración de LPS se puede analizar mediante un ensayo de lisado de amebocitos de limulus. Si el rendimiento es bajo OMV, unaetapa de concentración adicional a través de filtros centrífugos se podría realizar, que no se hace aquí. Si el rendimiento fue menor de lo esperado, se descartaron los OMV.
Como parte de los esfuerzos en curso para aclarar los mecanismos biológicos y funciones detrás de las OMV, la influencia de diferentes condiciones de estrés sobre la producción de OMV podría ponerse a prueba. La privación de nutrientes, cambios en la temperatura de incubación, o la exposición a los agentes nocivos podría tener un impacto sobre la secreción de OMV 31. Las posibles condiciones de estrés se discuten en el protocolo por Klimentová y Stulik 32. Por otra parte, los mutantes de L. pneumophila hiper o hypovesiculating se podrían generar. Las diferentes preparaciones de OMV podrían entonces ser analizadas en experimentos de infección con los macrófagos, los explantes de tejido de pulmón humano (descrito en la Referencia 17), o incluso en modelos in vivo. Además del papel de las OMV en la señalización inmune innato, su influencia en la comunicación bacterianase pueden abordar experimentalmente. Además, el impacto de varias cascadas de señalización inmune innata podría ser analizado por el uso de células knockout murinos o la generación de CRISPR knockouts / Cas9 en líneas celulares humanas. Esta investigación básica en las OMV ayudará en el desarrollo de nuevas estrategias vacunales, que ya existen para la meningitis B transmitida por Neisseria meningitidis 33.
A partir del protocolo sobre el aislamiento y caracterización de OMV, se puede aplicar esto a otras bacterias Gram-negativas y de otras células huésped; sólo necesita ser ajustado para el crecimiento de las bacterias en un cultivo líquido. El protocolo publicado por Chutkan et al. proporciona información detallada sobre la generación de las OMV de Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa 30. La cultura no debe alcanzar la fase estacionaria tardía con el fin de evitar aumentos de bacterias lisadas y las proteínas contaminantes y membranas. Además, la dosis OMV utilizado para la estimulación de las células huésped necesita ser determinado de acuerdo con la cantidad de las OMV durante las infecciones presente in vivo, sin dejar de garantizar una baja tasa de citotoxicidad. De esta manera, el papel patológico de las OMV, su impacto en la comunicación entre las especies, y las interacciones huésped-patógeno podría ser examinada.
Para estudiar más a fondo el papel de L. pneumophila las OMV en la neumonía, son necesarias preparaciones estandarizadas de OMV con suficientes rendimientos y la infección experimentos comparables. Este protocolo ayudará a estandarizar los procedimientos de aislamiento y de extender los estudios de OMV a otras bacterias Gram-negativas y a otras células huésped. Además, las investigaciones se beneficiará de la detallada en el conocimiento vitro, que puede ser usado para extender los experimentos en los ajustes in vivo. En el futuro, este protocolo podría ampliarse para el aislamiento de las OMV a partir de material biológico primario, tales como suero o lav broncoalveolarfluido de edad, para profundizar en la composición de las OMV liberada en condiciones fisiológicas. Esto ayudará a determinar los parámetros clave de la composición de OMV y para comprender las propiedades de las OMV -generated in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al Prof. Dr. Markus Schnare para que nos proporciona TLR2 – / – y TLR2 / 4 – / – ratones y el Prof. Dr. Carsten Kirschning de TRIF / MyD88 – / – ratones. Las partes de este trabajo ha sido financiado por el Ministerio Federal de Educación und Forschung (e: bio miRSys – FKZ 0316175B, e: Med CAPSYS – FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/), y Montes de Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE médicos RNomics – FKZ 519/03 / 00.001- (0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), todos a BS.
10 cm petridish | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 82.1473 | |
70 Ti rotor | Beckman Coulter Incorporation (California, USA) | 337922 | |
ACES | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9138.2 | |
activated charcoal | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | X865.2 | |
agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5210.2 | |
Columbia agar with 5 % sheep blood | Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | 254005 | |
cuvettes | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 67.742 | |
ELISA (human) | BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | IL-8: 555244 IL-6: 550799 | |
ELISA (murine) | DuoSet, R&D (Minneapolis, USA) | CXCL1: DY453-05 | |
Fe(NO3)3x9H2O | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5632.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 10270-106 | |
Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 40830469 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 75004515 | |
Inoculation loop | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 86.1567.010 | |
KOH | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 6751.1 | |
L. pneumophila Corby | — | — | kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany) |
L. pneumophila Corby ΔflaA | — | — | kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany) |
L-cystein | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | ||
mBMDM | — | — | kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany) |
PBS | Biochrom GmbH (Berlin, Germany) | L 1825 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | P8139-1MG | |
rotating shaker (MaxQ 6000) | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | SHKE6000 | |
RPMI 1640 high glucose | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 11875-093 | |
saponin | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9622.1 | |
Ultrospec 10 | Biochrom Ltd (Cambridge, England) | 80-2116-30 | |
sterile filter (pore size: 0.22 µm) | Corning Incorporated (new York, USA) | 431096 | |
THP-1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | 88081201-1VL | |
Sorvall Discovery 100 SE | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | ||
yeast extract | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 2363.2 | |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 23225 |