Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

Resumo

As mitocôndrias pode utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (Δ _Ψm) para sequestrar cálcio ^{(Ca2 +),} o que lhes permite moldar citosólica de Ca ²⁺ de sinalização dentro da célula. Descreve-se um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca ²⁺ de fixação e ΔΨ _m em células vivas utilizando corantes fluorescentes e microscopia confocal.

Resumo

Para além do seu papel fundamental na geração de ATP, mitocôndrias também actuar como cálcio local (Ca ^2+), tampões para regular firmemente concentração intracelular ^{de Ca2 +.} Para fazer isso, as mitocôndrias utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (ΔΨ _m) para sequestrar Ca ^2+. O influxo de ^{Ca2 +} para as mitocôndrias estimula três desidrogenases limitantes da velocidade do ciclo do ácido cítrico, aumentando a transferência de electrões através da fosforilação oxidativa (FOX) complexos. Esta estimulação mantém ΔΨ _m, que é temporariamente dissipada como os iões de cálcio positivos atravessar a membrana mitocondrial interna na matriz mitocondrial.

Descrevemos aqui um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca ²⁺ captação e ΔΨ _m em células vivas usando microscopia confocal. Por permeabilização das células, o Ca ²⁺ mitocondrial podeser medida utilizando o indicador fluorescente de Ca ²⁺ Fluo-4, AM, com medição de ΔΨ _m utilizando o corante fluorescente de tetrametilrodamina, éster metílico, perclorato (TMRM). A vantagem deste sistema é que existe muito pouca sobreposição espectral entre os corantes fluorescentes, permitindo uma medição precisa de Ca ²⁺ e mitocondrial ΔΨ _m simultaneamente. Utilizando a adição sequencial de alíquotas de Ca ^2+, Ca ²⁺ mitocondrial captação pode ser monitorizada, e a concentração na qual Ca ²⁺ induz a transição da permeabilidade da membrana mitocondrial e a perda de ΔΨ _m determinada.

Introdução

As mitocôndrias desempenham um papel importante na regulação da concentração intracelular ^{de Ca2 +,} agindo como locais ^{de Ca2 +} tampões ^1. Ca ²⁺ entra as mitocôndrias através da uniporter ^{Ca2 +,} um processo conduzido por o gradiente electroquímico que existe através da membrana mitocondrial interna (ΔΨ _m) ^2. Uma vez dentro da matriz mitocondrial, ^{Ca2 +} pode activar a fosforilação oxidativa, estimulando três desidrogenases limitantes da velocidade do ciclo de ácido cítrico ^3. Esta estimulação mantém ΔΨ _m, que é temporaria....

Protocolo

1. Preparação de células

1. Cultivar células em placas de cultura celular de 10 cm ou 75 cm ² frascos em meio de cultura [10 ml de Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 5% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS) e 1x penicilina / estreptomicina (P / S )] a 37 ° C / 5% de CO _2.
2. Para colher as células, meios remover por aspiração, em seguida, lava-se com 5 ml de 1x tampão de fosfatos salino (PBS 1x). Remover PBS 1x por aspiração, em seguida, adicionar 1,5 ml de 0,25% (w / v) de tripsina / 0,25% (w / v) de ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) e incubar a 37 ° C / 5% de CO ₂ durante 2 min. Toque prato ....

Resultados

Nós temos usado este protocolo para examinar os efeitos de uma mutação MT-ND5 sobre a capacidade das mitocôndrias de células 143B para o buffer aumenta em cálcio ^12. No exemplo mostrado aqui, células 143B de controlo foram carregadas com Fluo-TMRM e 4, antes de SOU permeabilização com digitonina. Após 5 min de imagiologia, oito adições sequenciais de uma diluição 1: 100 de 40 mM de _CaCl2 exógenos foram feitos, com o Ca ²⁺ concentraçã.......

Discussão

O cálcio desempenha um papel fundamental em muitos processos celulares, incluindo a contracção do músculo, sinalização neuronal e a proliferação celular ^13. Aumentos nas concentrações de cálcio celular são frequentemente associados com a demanda de energia, com o cálcio capaz de estimular diretamente a fosforilação oxidativa mitocondrial para aumentar a geração de ATP ^3. Portanto, é essencial que nós temos a capacidade de controlar eficazmente o acúmulo de cálcio mitocondr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)	ThermoFisher	10566016
soro fetal bovino (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x solução salina tamponada com fosfato (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicilina/estreptomicina (p/s)	ThermoFisher	15140122
0,25% Tripsina/0,25% EDTA	ThermoFisher
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glicose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malato	Sigma-Aldrich	M1000
glutamato	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ livre Hank' s solução salina tamponada (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetrametilrodamina, éster metílico, perclorato (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 éster acetoximetílico (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimetilsulfóxido (DMSO)	ThermoFisher	D12345
cianeto de carbonila p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonina	Sigma-Aldrich	D141
	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacitômetro	VWR	631-0925
Placas de cultura de células de 10 cm	Frascos de	COR430167 de
células de 75 cm2	Corning	COR430641

25200056 cultura