Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Summary

Mitochondria kann das elektrochemische Potential über ihre innere Membran (Δ _{& psi; m)} verwenden , Calcium (Ca ²⁺⁾ zu maskieren, so dass sie cytosolischen Ca ²⁺ zu formen innerhalb der Zelle signalisiert. Wir beschreiben ein Verfahren zum gleichzeitigen Messen Mitochondrien Ca ²⁺ -Aufnahme und ΔΨ _m in lebenden Zellen Fluoreszenzfarbstoffe und konfokale Mikroskopie.

Abstract

Abgesehen von ihrer wesentliche Rolle bei der ATP zu erzeugen, Mitochondrien wirken auch als lokale Calcium (Ca ²⁺⁾ Puffer zu eng regulieren intrazelluläre Ca2 ⁺ -Konzentration. Dazu nutzen Mitochondrien das elektrochemische Potential über ihre innere Membran (ΔΨ _m) zu sequestrieren Ca ^2+. Der Zustrom von Ca ²⁺ in die Mitochondrien stimuliert drei geschwindigkeitsbestimmend Dehydrogenasen des Zitronensäurezyklus, Erhöhung der Elektronentransfer durch die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) Komplexe. Diese Stimulation unterhält ΔΨ _m, die vorübergehend als die positiven Calciumionen überqueren die inneren Mitochondrienmembran in die mitochondriale Matrix abgeführt wird.

Wir beschreiben hier ein Verfahren zur gleichzeitigen Messung von Mitochondrien Ca ²⁺ -Aufnahme und ΔΨ _m in lebenden Zellen konfokalen Mikroskopie. Durch die Permeabilisierung der Zellen, Mitochondrien – Ca ²⁺ kannVerwendung der fluoreszierenden Ca ²⁺ Indikator Fluo-4, AM, gemessen werden mit der Messung der ΔΨ _m den Fluoreszenzfarbstoff Tetramethylrhodamin Verwendung von Methylester, Perchlorat (TMRM). Der Vorteil dieses Systems ist , dass es sehr wenig spektrale Überlappung zwischen den fluoreszierenden Farbstoffen, so dass eine genaue Messung der mitochondrialen Ca ²⁺ und ΔΨ _m gleichzeitig. Verwendung der sequentiellen Zugabe von Ca ²⁺ Aliquots können mitochondriale Ca ²⁺ -Aufnahme überwacht werden, und die Konzentration , bei der Ca ²⁺ mitochondrialen Membranpermeabilität Übergang und den Verlust von ΔΨ induziert _m bestimmt.

Introduction

Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle intrazelluläre Ca2 ⁺ -Konzentration in der Regulation von ¹ als lokale Ca ²⁺ Puffer wirken. Ca ²⁺ tritt in die Mitochondrien über das Ca ²⁺ Uniporter, ein Verfahren , mit dem elektrochemischen Gradienten angetrieben, der über den inneren Mitochondrienmembran (ΔΨ _m) ² existiert. Einmal in der mitochondrialen Matrix, Ca ²⁺ kann die oxidative Phosphorylierung aktivieren , indem drei geschwindigkeitsbegrenzenden stimulierenden Dehydrogenasen des Zitronensäurezyklus ^3. Diese Stimulation unterhält ΔΨ _m, die vorübergehend als die positiven Calciumionen überqueren die inneren Mitochondrienmembran in die mitochondriale Matrix abgeführt wird. Wenn der Ca ²⁺ -Konzentration in den Mitochondrien sehr hoch wird, kann mitochondrial permeability transition eingeleitet werden, was zur Dissipation von ΔΨ _m, die cessation der oxidativen Phosphorylierung und die Induktion von Zelltod – Signalwege ^4.

Die wichtige Rolle, die Mitochondrien in der räumlichen Pufferung von zellulären Kalzium spielen macht die genaue Überwachung der mitochondrialen Kalzium kritisch. Es wurden verschiedene Verfahren etabliert mitochondrialen Calcium zu überwachen, einschließlich der Verwendung von Rhodamin-basierte Farbstoffe. Ein solcher Farbstoff, Rhod-2, AM, ist sehr effektiv bei der Aufteilung in die Mitochondrien mitochondrialen Ca ²⁺ -Spiegel ⁵ zu ^{messen, 6.} Jedoch muss darauf verwendet werden, wie einige Farbstoff in anderen Organellen, wie Liposomen ansammelt, oder verbleiben in der Zell-Cytosol. Dennoch können Downstream – Analysen ⁷ diese Signale von den aus den Mitochondrien zu unterscheiden , eingesetzt werden.

Eine andere Technik zur mitochondrialen Kalzium Monitor nutzt fluoreszierende Reporterkonstrukte ⁸ </s up>. Der Vorteil dieser genetisch codierten Sonden ist, dass sie gezielt durch die Verwendung endogener N-terminalen Peptide in die Mitochondrien ziel werden, beispielsweise die N-terminale Targeting-Signal des menschlichen COX-Untereinheit VIII. Dieses System wurde verwendet , um eine mitochondriale gezielte Aequorin Sonde zu erzeugen , die extrem nützlich für die Untersuchung der mitochondrialen Calcium erwiesen hat Signalisierungs ^9. Der Hauptnachteil dieser genetisch codierten Sonden ist, dass sie in die Zellen durch transiente Expression eingeführt werden müssen (was nicht durchführbar für bestimmte Zelltypen und unterschiedliche Ergebnisse produzieren kann) oder durch stabile Expressionssysteme zu schaffen (was zeitaufwändig).

Um die Probleme zu umgehen oben dargelegt, haben wir ein neues Protokoll zur Messung der mitochondrialen Ca2 ⁺ und ΔΨ _m gleichzeitig entwickelt. Dieses Protokoll basiert auf einem vorher beschriebenen Verfahren, die permeabilisierten Zellen exogene Calcium fügts = "xref"> 10. Unser Protokoll hat drei wesentliche Vorteile gegenüber anderen Methoden: Zum einen nutzen wir Fluo-4, AM und TMRM mitochondrialen Ca ²⁺ zu überwachen und ΔΨ _m, zwei Farbstoffe , die sehr unterschiedliche spektrale Eigenschaften aufweisen; Zweitens werden die Zellen permeabilisiert so daß der Fluo-4 – Signal nur mitochondrialen Ca ²⁺ und Ca ²⁺ nicht an andere Organellen oder Zell – Cytosol lokalisiert ist , zu erfassen; und drittens, die Verwendung von Fluo-4 zu mitochondrialen Ca ²⁺ erkennen ermöglicht eine schnelle und einfache Zellfärbung, negiert alle Zelle Transfektion oder Transformation Probleme, die bestehen , wenn genetisch kodierte Sonden verwendet.

Protocol

1. Herstellung von Zellen Wachsen Zellen auf 10 cm Zellkulturschalen oder 75 cm 2 -Kolben in Kulturmedium [10 ml Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) , ergänzt mit 5% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS) und 1 x Penicillin / Streptomycin (P / S )] bei 37 ° C / 5% CO 2. Um Zellen ernten, entfernen Medien durch Absaugen, dann waschen mit 5 ml 1x phosphatgepufferter Salzlösung (1x PBS). Entfernen 1x PBS durch Absaugen, dann wurden 1,5 ml 0,25% addieren (w / v) Trypsin / 0,25% …

Representative Results

Wir haben dieses Protokoll verwendet , um die Auswirkungen einer MT-ND5 Mutation auf die Fähigkeit der Zelle 143B Mitochondrien zu untersuchen Erhöhungen 12 Calcium zu puffern. In dem hier gezeigten Beispiel wurden Kontroll 143B Zellen beladen mit TMRM und Fluo-4, AM vor Permeabilisierung mit Digitonin. Nach 5 min der Bildgebung, acht aufeinanderfolgende Zugaben einer 1: 100 – Verdünnung von 40 mM CaCl 2 exogene hergestellt wurden, mit der l…

Discussion

Calcium spielt eine wichtige Rolle in vielen Zellprozessen, einschließlich Muskelkontraktion, neuronaler Signalgebung und Zellproliferation ^13. Erhöhungen der Zelle Calciumkonzentrationen sind oft mit Energiebedarf verbunden sind , mit Kalzium können direkt mitochondriale oxidative Phosphorylierung zu stimulieren ATP Generation ³ zu erhöhen. Es ist daher wichtig, dass wir die Fähigkeit, effektiv überwachen mitochondriale Calciumakkumulation und der Lage sein, zu verg…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641