Mitochondria kann das elektrochemische Potential über ihre innere Membran (Δ & psi; m) verwenden , Calcium (Ca 2+) zu maskieren, so dass sie cytosolischen Ca 2+ zu formen innerhalb der Zelle signalisiert. Wir beschreiben ein Verfahren zum gleichzeitigen Messen Mitochondrien Ca 2+ -Aufnahme und ΔΨ m in lebenden Zellen Fluoreszenzfarbstoffe und konfokale Mikroskopie.
Abgesehen von ihrer wesentliche Rolle bei der ATP zu erzeugen, Mitochondrien wirken auch als lokale Calcium (Ca 2+) Puffer zu eng regulieren intrazelluläre Ca2 + -Konzentration. Dazu nutzen Mitochondrien das elektrochemische Potential über ihre innere Membran (ΔΨ m) zu sequestrieren Ca 2+. Der Zustrom von Ca 2+ in die Mitochondrien stimuliert drei geschwindigkeitsbestimmend Dehydrogenasen des Zitronensäurezyklus, Erhöhung der Elektronentransfer durch die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) Komplexe. Diese Stimulation unterhält ΔΨ m, die vorübergehend als die positiven Calciumionen überqueren die inneren Mitochondrienmembran in die mitochondriale Matrix abgeführt wird.
Wir beschreiben hier ein Verfahren zur gleichzeitigen Messung von Mitochondrien Ca 2+ -Aufnahme und ΔΨ m in lebenden Zellen konfokalen Mikroskopie. Durch die Permeabilisierung der Zellen, Mitochondrien – Ca 2+ kannVerwendung der fluoreszierenden Ca 2+ Indikator Fluo-4, AM, gemessen werden mit der Messung der ΔΨ m den Fluoreszenzfarbstoff Tetramethylrhodamin Verwendung von Methylester, Perchlorat (TMRM). Der Vorteil dieses Systems ist , dass es sehr wenig spektrale Überlappung zwischen den fluoreszierenden Farbstoffen, so dass eine genaue Messung der mitochondrialen Ca 2+ und ΔΨ m gleichzeitig. Verwendung der sequentiellen Zugabe von Ca 2+ Aliquots können mitochondriale Ca 2+ -Aufnahme überwacht werden, und die Konzentration , bei der Ca 2+ mitochondrialen Membranpermeabilität Übergang und den Verlust von ΔΨ induziert m bestimmt.
Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle intrazelluläre Ca2 + -Konzentration in der Regulation von 1 als lokale Ca 2+ Puffer wirken. Ca 2+ tritt in die Mitochondrien über das Ca 2+ Uniporter, ein Verfahren , mit dem elektrochemischen Gradienten angetrieben, der über den inneren Mitochondrienmembran (ΔΨ m) 2 existiert. Einmal in der mitochondrialen Matrix, Ca 2+ kann die oxidative Phosphorylierung aktivieren , indem drei geschwindigkeitsbegrenzenden stimulierenden Dehydrogenasen des Zitronensäurezyklus 3. Diese Stimulation unterhält ΔΨ m, die vorübergehend als die positiven Calciumionen überqueren die inneren Mitochondrienmembran in die mitochondriale Matrix abgeführt wird. Wenn der Ca 2+ -Konzentration in den Mitochondrien sehr hoch wird, kann mitochondrial permeability transition eingeleitet werden, was zur Dissipation von ΔΨ m, die cessation der oxidativen Phosphorylierung und die Induktion von Zelltod – Signalwege 4.
Die wichtige Rolle, die Mitochondrien in der räumlichen Pufferung von zellulären Kalzium spielen macht die genaue Überwachung der mitochondrialen Kalzium kritisch. Es wurden verschiedene Verfahren etabliert mitochondrialen Calcium zu überwachen, einschließlich der Verwendung von Rhodamin-basierte Farbstoffe. Ein solcher Farbstoff, Rhod-2, AM, ist sehr effektiv bei der Aufteilung in die Mitochondrien mitochondrialen Ca 2+ -Spiegel 5 zu messen, 6. Jedoch muss darauf verwendet werden, wie einige Farbstoff in anderen Organellen, wie Liposomen ansammelt, oder verbleiben in der Zell-Cytosol. Dennoch können Downstream – Analysen 7 diese Signale von den aus den Mitochondrien zu unterscheiden , eingesetzt werden.
Eine andere Technik zur mitochondrialen Kalzium Monitor nutzt fluoreszierende Reporterkonstrukte 8 </s up>. Der Vorteil dieser genetisch codierten Sonden ist, dass sie gezielt durch die Verwendung endogener N-terminalen Peptide in die Mitochondrien ziel werden, beispielsweise die N-terminale Targeting-Signal des menschlichen COX-Untereinheit VIII. Dieses System wurde verwendet , um eine mitochondriale gezielte Aequorin Sonde zu erzeugen , die extrem nützlich für die Untersuchung der mitochondrialen Calcium erwiesen hat Signalisierungs 9. Der Hauptnachteil dieser genetisch codierten Sonden ist, dass sie in die Zellen durch transiente Expression eingeführt werden müssen (was nicht durchführbar für bestimmte Zelltypen und unterschiedliche Ergebnisse produzieren kann) oder durch stabile Expressionssysteme zu schaffen (was zeitaufwändig).
Um die Probleme zu umgehen oben dargelegt, haben wir ein neues Protokoll zur Messung der mitochondrialen Ca2 + und ΔΨ m gleichzeitig entwickelt. Dieses Protokoll basiert auf einem vorher beschriebenen Verfahren, die permeabilisierten Zellen exogene Calcium fügts = "xref"> 10. Unser Protokoll hat drei wesentliche Vorteile gegenüber anderen Methoden: Zum einen nutzen wir Fluo-4, AM und TMRM mitochondrialen Ca 2+ zu überwachen und ΔΨ m, zwei Farbstoffe , die sehr unterschiedliche spektrale Eigenschaften aufweisen; Zweitens werden die Zellen permeabilisiert so daß der Fluo-4 – Signal nur mitochondrialen Ca 2+ und Ca 2+ nicht an andere Organellen oder Zell – Cytosol lokalisiert ist , zu erfassen; und drittens, die Verwendung von Fluo-4 zu mitochondrialen Ca 2+ erkennen ermöglicht eine schnelle und einfache Zellfärbung, negiert alle Zelle Transfektion oder Transformation Probleme, die bestehen , wenn genetisch kodierte Sonden verwendet.
Calcium spielt eine wichtige Rolle in vielen Zellprozessen, einschließlich Muskelkontraktion, neuronaler Signalgebung und Zellproliferation 13. Erhöhungen der Zelle Calciumkonzentrationen sind oft mit Energiebedarf verbunden sind , mit Kalzium können direkt mitochondriale oxidative Phosphorylierung zu stimulieren ATP Generation 3 zu erhöhen. Es ist daher wichtig, dass wir die Fähigkeit, effektiv überwachen mitochondriale Calciumakkumulation und der Lage sein, zu verg…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dr. Kirstin Elgass und Dr. Sarah Credo von der Monash Micro Imaging für die technische Unterstützung und den Wellcome Trust und Medical Research Council in Großbritannien für die finanzielle Unterstützung. MMcK ist das Australian Research Council Zukunft Fellowship Scheme (FT120100459), die William Buckland-Stiftung, die australische Mitochondrial Disease Foundation (AMDF), der Hudson-Institut für Medizinische Forschung und Monash University unterstützt. Diese Arbeit wurde von der Regierung von Victoria Operational Infrastruktur Support Scheme unterstützt.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 |
fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 |
1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 |
100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 |
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 |
NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 |
HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 |
malate | Sigma-Aldrich | M1000 |
glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 |
ADP | Sigma-Aldrich | A5285 |
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 |
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 |
Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 |
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 |
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 |
digitonin | Sigma-Aldrich | D141 |
thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 |
Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP |
hemacytometer | VWR | 631-0925 |
10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 |
75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |