Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

Summary

As mitocôndrias pode utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (Δ _Ψm) para sequestrar cálcio ^{(Ca2 +),} o que lhes permite moldar citosólica de Ca ²⁺ de sinalização dentro da célula. Descreve-se um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca ²⁺ de fixação e ΔΨ _m em células vivas utilizando corantes fluorescentes e microscopia confocal.

Abstract

Para além do seu papel fundamental na geração de ATP, mitocôndrias também actuar como cálcio local (Ca ^2+), tampões para regular firmemente concentração intracelular ^{de Ca2 +.} Para fazer isso, as mitocôndrias utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (ΔΨ _m) para sequestrar Ca ^2+. O influxo de ^{Ca2 +} para as mitocôndrias estimula três desidrogenases limitantes da velocidade do ciclo do ácido cítrico, aumentando a transferência de electrões através da fosforilação oxidativa (FOX) complexos. Esta estimulação mantém ΔΨ _m, que é temporariamente dissipada como os iões de cálcio positivos atravessar a membrana mitocondrial interna na matriz mitocondrial.

Descrevemos aqui um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca ²⁺ captação e ΔΨ _m em células vivas usando microscopia confocal. Por permeabilização das células, o Ca ²⁺ mitocondrial podeser medida utilizando o indicador fluorescente de Ca ²⁺ Fluo-4, AM, com medição de ΔΨ _m utilizando o corante fluorescente de tetrametilrodamina, éster metílico, perclorato (TMRM). A vantagem deste sistema é que existe muito pouca sobreposição espectral entre os corantes fluorescentes, permitindo uma medição precisa de Ca ²⁺ e mitocondrial ΔΨ _m simultaneamente. Utilizando a adição sequencial de alíquotas de Ca ^2+, Ca ²⁺ mitocondrial captação pode ser monitorizada, e a concentração na qual Ca ²⁺ induz a transição da permeabilidade da membrana mitocondrial e a perda de ΔΨ _m determinada.

Introduction

As mitocôndrias desempenham um papel importante na regulação da concentração intracelular ^{de Ca2 +,} agindo como locais ^{de Ca2 +} tampões ^1. Ca ²⁺ entra as mitocôndrias através da uniporter ^{Ca2 +,} um processo conduzido por o gradiente electroquímico que existe através da membrana mitocondrial interna (ΔΨ _m) ^2. Uma vez dentro da matriz mitocondrial, ^{Ca2 +} pode activar a fosforilação oxidativa, estimulando três desidrogenases limitantes da velocidade do ciclo de ácido cítrico ^3. Esta estimulação mantém ΔΨ _m, que é temporariamente dissipada como os iões de cálcio positivos atravessar a membrana mitocondrial interna na matriz mitocondrial. Se a concentração de Ca ²⁺ no interior da mitocôndria se torna muito alta, a transição de permeabilidade mitocondrial pode ser iniciado, resultando na dissipação de ΔΨ _m, o cessatioN da fosforilação oxidativa e a indução de morte celular percursos de sinalização ^4.

O importante papel que as mitocôndrias jogar no tamponamento espacial de cálcio celular faz com que o monitoramento preciso do cálcio mitocondrial crítica. Vários métodos têm sido estabelecido para controlar ccio mitocondrial, incluindo a utilização de corantes à base de rodamina. Um tal tintura, Rhod-2, AM, é bastante eficaz no particionamento para a mitocôndria para medir mitocondriais níveis de Ca ^{2+ 5, 6.} No entanto, o cuidado deve ser usado como algum corante irá acumular em outras organelas, tais como lipossomas, ou permanecer no citoplasma celular. No entanto, análises a jusante pode ser utilizado para distinguir estes sinais dos da mitocôndria ^7.

Uma outra técnica para monitorar cálcio mitocondrial utiliza repórter fluorescente constrói ⁸ </s -se>. O benefício destas sondas geneticamente codificados é que eles podem ser especificamente dirigidas para a mitocôndria utilizando péptidos endógenos N-terminais, por exemplo o sinal de direccionamento do terminal N da subunidade de COX VIII humano. Este sistema tem sido empregado para gerar uma sonda aequorina alvejado-mitocondrial, que revelou-se extremamente útil para a investigação de cálcio mitocondrial sinalização ^9. A principal desvantagem destas sondas geneticamente codificados é que eles têm de ser introduzidos nas células por expressão transitória (que não é viável para certos tipos de células e pode produzir resultados variáveis) ou através da criação de sistemas de expressão estáveis ​​(que é demorado).

Para contornar os problemas acima referidos, temos desenvolvido um novo protocolo para medir mitocondrial Ca ²⁺ e ΔΨ _m simultaneamente. Este protocolo baseia-se num método anteriormente descrito que adiciona cálcio exógeno para as células permeabilizadass = "xref"> 10. Nosso protocolo tem três vantagens principais em relação a outros métodos: em primeiro lugar, usamos Fluo-4, AM e TMRM para monitorar Ca ²⁺ e mitocondrial ΔΨ _m, dois corantes que têm propriedades espectrais muito distintas; Em segundo lugar, as células são permeabilizadas de modo a que o sinal de Fluo-4 apenas está detectando mitocondrial ^{de Ca2 +} e ^{de Ca2 +} não localizada para outros organelos ou o citosol da célula; e em terceiro lugar, a utilização de Fluo-4 para detectar Ca ²⁺ mitocondrial permite a coloração de células rápido e simples, eliminando qualquer problema de transfecção de células ou de transformação que existem se utilizando sondas geneticamente codificados.

Protocol

1. Preparação de células Cultivar células em placas de cultura celular de 10 cm ou 75 cm 2 frascos em meio de cultura [10 ml de Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 5% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS) e 1x penicilina / estreptomicina (P / S )] a 37 ° C / 5% de CO 2. Para colher as células, meios remover por aspiração, em seguida, lava-se com 5 ml de 1x tampão de fosfatos salino (PBS 1x). Remover PBS 1x por aspiração, em seguida, adicionar 1,5 m…

Representative Results

Nós temos usado este protocolo para examinar os efeitos de uma mutação MT-ND5 sobre a capacidade das mitocôndrias de células 143B para o buffer aumenta em cálcio 12. No exemplo mostrado aqui, células 143B de controlo foram carregadas com Fluo-TMRM e 4, antes de SOU permeabilização com digitonina. Após 5 min de imagiologia, oito adições sequenciais de uma diluição 1: 100 de 40 mM de CaCl2 exógenos foram feitos, com o Ca 2+</s…

Discussion

O cálcio desempenha um papel fundamental em muitos processos celulares, incluindo a contracção do músculo, sinalização neuronal e a proliferação celular ^13. Aumentos nas concentrações de cálcio celular são frequentemente associados com a demanda de energia, com o cálcio capaz de estimular diretamente a fosforilação oxidativa mitocondrial para aumentar a geração de ATP ^3. Portanto, é essencial que nós temos a capacidade de controlar eficazmente o acúmulo…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641