Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente
Summary
Las mitocondrias pueden utilizar el potencial electroquímico a través de su membrana interna (Δ Ψm) para secuestrar calcio (Ca2 +), lo que les permite dar forma Ca 2+ citosólico de señalización dentro de la célula. Se describe un método para medir simultáneamente las mitocondrias Ca 2+ absorción y ΔΨ m en células vivas utilizando colorantes fluorescentes y microscopía confocal.
Abstract
Aparte de su papel esencial en la generación de ATP, las mitocondrias también actúan como amortiguadores de calcio locales para regular fuertemente la concentración intracelular de Ca2 + (Ca2 +). Para hacer esto, mitocondrias utilizan el potencial electroquímico a través de su membrana interna (ΔΨ m) para secuestrar Ca 2 +. La afluencia de Ca2 + en la mitocondria estimula tres deshidrogenasas que limitan la velocidad del ciclo del ácido cítrico, el aumento de la transferencia de electrones a través de la fosforilación oxidativa (fosforilación oxidativa) complejos. Esta estimulación mantiene ΔΨ m, que se disipa temporalmente como los iones de calcio positivos cruzar la membrana interna mitocondrial en la matriz mitocondrial.
Se describe aquí un método para medir simultáneamente las mitocondrias Ca 2+ absorción y ΔΨ m en células vivas mediante microscopía confocal. Por permeabilización de las células, Ca 2 + mitocondrial puedemedirse utilizando el Ca 2 + indicador fluorescente Fluo-4 AM, con la medición de ΔΨ m usando el colorante fluorescente tetrametilrodamina, éster metílico, el perclorato (TMRM). El beneficio de este sistema es que hay muy poco solapamiento espectral entre los colorantes fluorescentes, lo que permite una medición precisa de Ca 2 + mitocondrial y ΔΨ m simultáneamente. Uso de la adición secuencial de Ca 2+ alícuotas, Ca 2 + mitocondrial captación pueden ser monitoreados, y la concentración a la que Ca2 + induce la transición de la permeabilidad de la membrana mitocondrial y la pérdida de ΔΨ m determinado.
Introduction
Las mitocondrias juegan un papel importante en la regulación de la concentración intracelular de Ca2 +, actuando como locales Ca 2 + buffers 1. Ca 2+ entra en la mitocondria a través de la uniporter Ca2 +, un proceso impulsado por el gradiente electroquímico que existe a través de la membrana interna mitocondrial (ΔΨ m) 2. Una vez dentro de la matriz mitocondrial, Ca 2+ puede activar la fosforilación oxidativa mediante la estimulación de tres deshidrogenasas limitantes de la velocidad del ciclo del ácido cítrico 3. Esta estimulación mantiene ΔΨ m, que se disipa temporalmente como los iones de calcio positivos cruzar la membrana interna mitocondrial en la matriz mitocondrial. Si la concentración de Ca2 + dentro de las mitocondrias se vuelve muy alta, la transición de permeabilidad mitocondrial puede ser iniciado, dando lugar a la disipación de ΔΨ m, la cessation de la fosforilación oxidativa y la inducción de la muerte celular vías 4 de señalización.
El importante papel que las mitocondrias desempeñan en el búfer espacial de calcio celular hace que la supervisión precisa de calcio mitocondrial crítica. Se han establecido varios métodos para controlar de calcio mitocondrial, incluyendo el uso de colorantes a base de rodamina. Uno de estos colorantes, Rhod-2, AM, es muy eficaz en la partición a la mitocondria para medir los niveles de Ca2 + mitocondrial 5, 6. Sin embargo, se debe tener cuidado ya que algunos de colorante se acumulará en otros orgánulos, tales como liposomas, o permanecer en el citosol de la célula. Sin embargo, los análisis posteriores se pueden emplear para distinguir estas señales a los de la mitocondria 7.
Otra técnica para controlar de calcio mitocondrial utiliza reportero fluorescente construye 8 </s arriba>. El beneficio de estas sondas codificados genéticamente es que pueden ser dirigidos específicamente a la mitocondria mediante el uso de péptidos endógenos N-terminal, por ejemplo, la señal de direccionamiento N-terminal de la subunidad VIII de la COX humano. Este sistema se ha empleado para generar una sonda aequorina mitocondrial de orientación que ha demostrado ser extremadamente útil para la investigación mitocondrial de señalización 9 de calcio. El principal inconveniente de estas sondas codificados genéticamente es que necesitan para ser introducido en las células por la expresión transitoria (que no es factible para ciertos tipos de células y pueden producir resultados variables) o mediante la creación de sistemas de expresión estables (que está consumiendo tiempo).
Para evitar los problemas descritos anteriormente, hemos desarrollado un nuevo protocolo para medir mitocondrial de Ca2 + y ΔΨ m simultáneamente. Este protocolo se basa en un método descrito previamente que añade calcio exógeno a células permeabilizadass = "xref"> 10. Nuestro protocolo tiene tres ventajas principales con respecto a otros métodos: en primer lugar, utilizamos Fluo-4 AM y TMRM para supervisar Ca 2 + mitocondrial y ΔΨ m, dos colorantes que tienen propiedades espectrales muy distintas; En segundo lugar, las células se permeabilizaron de modo que la señal de Fluo-4 solamente está detectando mitocondrial Ca 2 + y Ca2 + no localiza en otros orgánulos o el citosol de la célula; y en tercer lugar, el uso de Fluo-4 para detectar Ca 2 + mitocondrial permite la tinción celular rápido y simple, anulando cualquier problema de transfección de células o de transformación que existen si el uso de sondas codificados genéticamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
El calcio juega un papel fundamental en muchos procesos celulares, incluyendo la contracción muscular, la señalización neuronal y la proliferación celular 13. Los aumentos en las concentraciones de calcio de células se asocian a menudo con la demanda de energía, con el calcio capaz de estimular directamente la fosforilación oxidativa mitocondrial para aumentar la generación de ATP 3. Por tanto, es esencial que tengamos la capacidad de controlar con eficacia la acum…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Se agradece al Dr. Kirstin Elgass y el Dr. Sarah Credo de Monash Micro Imaging para la asistencia técnica, y el Wellcome Trust y el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido para el apoyo financiero. MMcK se apoya el Consejo de Investigación Australiano futuro Plan de Becas (FT120100459), la Fundación William Buckland, La fundación de la enfermedad mitocondrial australiano (AMDF), El Instituto de Investigación Médica de Hudson y de la Universidad de Monash. Este trabajo fue apoyado por el Plan de Apoyo a la infraestructura operativa del Gobierno de Victoria.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 |
| 0.25% Trypsin / 0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
Referências
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