Intravitalmikroskopie und Thrombusinduktion im Ohrläppchen eines Hairless Maus

Summary

Das Ohr – Modell der haarlosen SKH1-Hr ^hr Maus ermöglicht intravitale Fluoreszenzmikroskopie der Mikrozirkulation und phototoxische Thrombus – Induktion ohne vorherige chirurgische Vorbereitung in dem untersuchten mikrovaskulären Bett. Daher ist das Ohr der nackten Maus eine ausgezeichnete In – vivo – Modell , um die komplexen Wechselwirkungen während mikrovaskuläre Thrombusbildung, Thrombus Evolution und Thrombolyse zu studieren.

Abstract

Thrombotischen Komplikationen von vaskulären Erkrankungen sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in den Industrienationen. Aufgrund der komplexen Wechselwirkungen zwischen zellulären und nicht-zellulären Blutbestandteilen während der Thrombusbildung, können zuverlässige Studien der Physiologie und Pathophysiologie der Thrombose nur in vivo durchgeführt werden. Daher stellt dieser Artikel ein Ohr – Modell in Nacktmäusen und konzentriert sich auf die in vivo Analyse der Mikrozirkulation, Thrombusbildung und Thrombus Evolution. Durch die Verwendung von intravitale Fluoreszenzmikroskopie und die intravenösen (iv) der Anwendung der jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffe, eine repetitive Analyse der Mikrozirkulation in der Ohrmuschel leicht durchgeführt werden kann, ohne die Notwendigkeit für chirurgische Vorbereitung. Darüber hinaus kann dieses Modell für die de – vivo – Studien der verschiedenen Emissionen angepasst werden, einschließlich Wundheilung, Reperfusionsschaden oder Angiogenese. Zusammenfassend ist das Ohr von Nacktmäusen ein ideales Modell für das in vivo Untersuchung der Mikrozirkulation der Haut in physiologischen oder pathophysiologischen Bedingungen und für die Bewertung der Reaktion auf verschiedene systemische oder topische Behandlungen.

Introduction

Der Zweck der vorliegenden Art ist die Technik der Intravitalmikroskopie an die Ohrmuschel des haarlosen Maus für die direkte Beobachtung und Analyse der Mikrozirkulation, die Thrombusbildung und Thrombus Entwicklung angewandt zu beschreiben. Mit einer Inzidenz von 1 in 1000 ist venöse Thrombose immer noch eine häufige Ursache von Morbidität. Obwohl Diagnostik, Präventionsstrategien und Therapien in den letzten Jahren entwickelt wurden, ein Drittel der Venenthrombose manifestiert sich als eine Lungenembolie ^1. Die arterielle Thrombose spielt eine entscheidende Rolle bei kardiovaskulären Erkrankungen, die die häufigste Todesursache in den Industrienationen sind. Die arterielle Thrombose auf der Grundlage der Bruch von atherosklerotischen Plaques in Herzanfällen, Mesenterial- Infarkte beteiligt und Apoplexie. Jede Operation macht subendothelialen Strukturen auf Blutkomponenten, ändert sich die Dynamik des Blutflusses und lähmt den Patienten. In endoprothetischen Chirurgie der unteren Extremitäten, organ transplantation und Klappenchirurgie Thrombose sind häufige Ursachen von Komplikationen. Die mikrovaskuläre Thrombose insbesondere verursacht häufig irreversible Schäden, aufgrund des Fehlens von klinischen Symptomen. Ebenso spielt die mikrovaskuläre Thrombose eine entscheidende Regel in mehreren Krankheiten, einschließlich thrombotische thrombozytopenische Purpura, Sepsis, disseminierte intravaskuläre Koagulation, Antiphospholipid-Syndrom und chronische venöse Insuffizienz, unter anderem.

Mehrere neue Medikamente zur Therapie und Vorbeugung von Thrombosen wurden in den letzten Jahren entwickelt, aber eine gerinnungshemmende Medikamente und Antikoagulantien haben noch Nebenwirkungen, Mangel-Antagonisten, und verfügen über lange Dauer Effekte. Diese Mängel führen zu Problemen in der medizinischen Notversorgung. Somit wird mehr Forschung notwendig , um die komplexen Prozesse aufzudecken , die während Thrombose auftreten, die kaum in vitro simuliert werden kann.

Die haarlos SKH1-Hr ^hr – Maus wurde 1926 in einem Zoo in London entdeckt.Dies macht die gut durchbluteten Ohrmuschel zugänglich Intravitalmikroskopie der Gefäße aufgrund eines Gendefekts auf dem Chromosom 14, verliert das Tier das Fell nach dem 10. Tag nach der Geburt. Die durchschnittliche Dicke des Ohrs ist 300 um. Es besteht aus zwei Schichten aus Dermis, die durch Knorpel getrennt ist. Auf der konvexen dorsalen Seite des Knorpels, 3 Gefäßbündel geben Sie das Ohrläppchen. Apikalen und basalen vaskuläre Bögen Shunts verbinden die drei Bündel. Die Venolen haben Durchmesser zwischen 200 & mgr; m (basal) und 10 um (apical). Engmaschige Kapillaren umgeben das leere Haar ² Follikel. Die Anatomie der haarlos SKH1-Hr ^hr Maus macht die Ohrmuschel ein leistungsfähiges und kostengünstiges Modell für Thrombose Forschung.

Protocol

Alle in – vivo – Experimente (7221.3-1-006 / 15) wurden nach den deutschen Rechtsvorschriften über den Schutz von Tieren und die NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Institut für Labortier Ressourcen, National Research Council) durchgeführt. 1. Allgemeine Haltung der Tiere Führen Sie die Experimente mit männlichen SKH1-Hr hr – Mäusen im Alter von 4 bis 6 Wochen. Verwenden Tiere mit einem Gewicht zwischen 20 und 25 g. </li…

Representative Results

Auswirkungen der Cannabinoid-Behandlung auf Thrombogenese Bei der Injektion von 0,05 ml von FITC-Dextran, phototoxischer Thrombus führt zu einer Induktion endothelialer Läsion und die Bildung eines parietalen Blutplättchenpfropfen (2 und 3). In der vorliegenden Studie, Thrombus – Induktion nach der ip – Injektion von Cannabinoiden (5 mg / kg Körpergewicht) oder Trägern führte zu einem throm…

Discussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte für die erfolgreiche Thrombusinduktion im Ohrläppchen von SKH1-Hr ^hr – Mäusen. Zur Fehlersuche werden die jeweiligen Schritte des Protokolls in Klammern angegeben.

Prüfungsbedingungen sind ideal bei jungen Tieren im Alter von 4 – 6 Wochen und mit geringer Verhornung der Epidermis. Bei älteren Tieren, ist die Qualität der Visualisierung des Gefäßes schlechter und weniger vergleichbar aufgrund des höheren Abstand zwischen der Hautoberfläch…

Materials

SKH-1/hr mice	Charles River	477	can be purchased from other vendors
standard laboratory food	ssniff Spezialdiaeten	V1594-0	can be purchased from other vendors
operation stereomicroscope	Leica	M651/M655	can be purchased from other vendors
intravital microscope	Zeiss	Axiotech Vario 100	can be purchased from other vendors
objective (20x/0.95)	Zeiss	20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR	can be purchased from other vendors
objective (63x/0.95)	Zeiss	63x/0,95 W; ACHROPLAN	can be purchased from other vendors
black and white CCD-camera	Pieper	FK 6990 IQ-S	can be purchased from other vendors
DVD-recorder	Panasonic	DMR-EX99V	can be purchased from other vendors
sodium chloride	Braun	5/12612055/1011	can be purchased from other vendors
Ketamine 10%	Bela pharm	F3901-6	can be purchased from other vendors
Xylazine 2%	Bayer	6293841.00.00	can be purchased from other vendors
FITC-dextran 5%	Sigma	46945-100MG-F	can be purchased from other vendors
dexapanthenol 5% eye ointment	Bayer	6029009.00.00	can be purchased from other vendors
formaldehyde 4%	Sigma	HT501128-4L	can be purchased from other vendors
DMSO	Sigma	472301	can be purchased from other vendors
coverslips 5 x 5 x 1 mm	Menzel	L4339	can be purchased from other vendors
plasters	Leukosilk	4683400	can be purchased from other vendors
centrifuge	Beckman Coulter	CLGS 15	can be purchased from other vendors
hematology analyzer	Sysmex	KX-21 A6980	can be purchased from other vendors
EDTA-blood tube	Sarstedt	201,341	can be purchased from other vendors
cotton swabs	Sanyo	604-A-1	can be purchased from other vendors
infrared light	Beurer	5/13855	can be purchased from other vendors
single use synringe	Braun	2020-08	can be purchased from other vendors
insulin syringe	Braun	9161502	can be purchased from other vendors
disposable hypodermic needles	Braun	465 7640	can be purchased from other vendors
end-to-end capillary	Sarstedt	19,447	can be purchased from other vendors
heating plate	Klaus Effenberg	OP-T 185/03	can be purchased from other vendors
scissors 14,5 cm	Aesculap	BC259R	can be purchased from other vendors
needle Holder	Aesculap	BM081R	can be purchased from other vendors
microforceps	Aesculap	BD331R	can be purchased from other vendors
microscissors	Aesculap	OC496R	can be purchased from other vendors
scalpel 21	Dahlhausen	11.000.00.511	can be purchased from other vendors
Prolene 7-0	Ethicon	XNEH7470	can be purchased from other vendors
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electrocautery	Servoprax	H40140	can be purchased from other vendors
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