Analizando Synaptic Modulación de<em> Drosophila melanogaster</em> Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz
Summary
Aquí mostramos cómo cuantificar el número y la distribución espacial de las zonas activas sinápticas en los fotorreceptores de Drosophila melanogaster, resaltada con un marcador molecular codificada genéticamente, y su modulación después de la exposición prolongada a la luz.
Abstract
El sistema nervioso tiene la notable capacidad de adaptación y respuesta a diversos estímulos. Este ajuste neuronal se logra en gran medida a través de la plasticidad sináptica en el plano. La zona activa (AZ) es la región en la membrana presináptica que media la liberación de neurotransmisores y está compuesto de una densa colección de proteínas de andamiaje. AZS de Drosophila melanogaster (Drosophila) fotorreceptores se someten a la remodelación molecular después de la exposición prolongada a la luz del ambiente natural. Así, el nivel de actividad neuronal puede reorganizar la composición molecular de la AZ y contribuir a la regulación de la salida funcional.
A partir de la exposición a la luz preparado mencionado arriba a la inmunohistoquímica, detalles de este protocolo la forma de cuantificar el número, la distribución espacial y el nivel de deslocalización de las moléculas sinápticas en AZS en fotorreceptores de Drosophila. El uso de análisis de imágenes software, se identificaron grupos de la componente de GFP fusionado AZ Bruchpilot para cada fotorreceptor R8 (R8) terminal del axón. Bruchpilot manchas detectadas fueron asignados automáticamente a los axones individuales R8. Para el cálculo de la distribución de frecuencia puntual a lo largo del axón, se implementó un software personalizado plugin. punto de inicio de cada axón y punto final se definieron de forma manual y la posición de cada punto Bruchpilot se proyectan en la línea de unión entre el inicio y el punto final. Además del número de grupos Bruchpilot, también cuantificó el nivel de deslocalización de Bruchpilot-GFP dentro de los grupos. Estas mediciones reflejan en detalle la dinámica sinápticas espacialmente resueltas en una sola neurona en condiciones ambientales diferentes a los estímulos.
Introduction
La modulación de la función sináptica contribuye a la notable capacidad del sistema nervioso para responder con precisión o adaptarse al cambio de los estímulos ambientales. Ajuste de la probabilidad de liberación de la vesícula presináptica es una forma de controlar la fuerza sináptica 1. La liberación de vesículas sinápticas se lleva a cabo en la Zona Activa (AZ), una región especializada de la membrana presináptica 2. El AZ se caracteriza por un casete de proteínas específicas 3, 4. La mayoría de las proteínas que contribuyen a la asamblea AZ están muy conservadas en los nematodos, insectos y mamíferos 5. Estudios recientes sugieren que el nivel de actividad neuronal regula la composición molecular de la AZ, que a su vez contribuye a la regulación de la salida funcional tanto in vitro como in vivo 6, 7,> 8. Hemos determinado anteriormente que AZS fotorreceptoras se someten a la remodelación molecular en Drosophila después de la exposición prolongada a la luz del ambiente natural de 9. En esta condición, se observó que el número de Bruchpilot (BRP) -positivo AZS se redujo en el axones fotorreceptoras.
Las proteínas Brp / REPARTO familia / ELKS son bloques de construcción fundamentales de AZS en vertebrados e invertebrados sinapsis 10. En los mutantes de Drosophila BRP, evocó la liberación de vesículas se suprime 11, 12. Los 17 residuos de aminoácidos C-terminales de Brp son esenciales para la agrupación de vesículas sinápticas en la Drosophila unión neuromuscular (NMJ) 13, 14. Estos estudios demostraron el papel central de esta molécula en la organización y la función AZ. Con una herramienta genética desarrollada recientemente, Synaptic etiquetado con recombinación (estrella), Brppuede observarse in vivo en tipos celulares específicos, en los niveles de expresión endógenos y en una sola resolución sinapsis 15. Esta herramienta hace que sea factible para evaluar la dinámica endógenos de sinapsis cuantitativamente en el sistema nervioso central complejo.
Se han realizado varios estudios que incluyen cuantificaciones sinápticas en base a los datos obtenidos de la microscopía confocal. alteraciones sinápticas se han evaluado mediante la medición de la longitud, el área, el volumen, la densidad y contando el número en base a aplicaciones de software sofisticados. Por ejemplo, el software gratuito ImageJ proporciona un método de cuantificación para el área sináptica total y medidas de densidad sináptica en la Drosophila NMJ 16. El número de sitios de colocalización de los marcadores pre y post-sinápticas se han cuantificado usando el plugin "puntos lagrimales Analizador" disponible en la plataforma de software ImageJ 17. Alternativamente, un multi-parprograma basado adigm entorno de computación numérica, Synapse Detector (SYND), puede rastrear automáticamente dendritas de las neuronas marcadas con un marcador fluorescente, y después cuantifica los niveles de proteína sináptica como una función de la distancia desde el cuerpo celular 18. El software de análisis de Synaptic puntos lagrimales (SynPAnal), ha sido diseñado para el análisis rápido de imágenes en 2D de las neuronas adquiridas de microscopía confocal o fluorescente. La función principal de este software es la cuantificación automática y rápida de la densidad y la intensidad de puntos lagrimales proteína 19. Recientemente, un algoritmo de detección automática de sinapsis basado en el aprendizaje ha sido generada para la cuantificación del número de sináptica en 3D 20, aprovechando el software asistida por visualización 3D Análisis (Vaa3D) 21.
software de análisis de imagen comercial también son herramientas poderosas para cuantificaciones sinápticas. Por ejemplo, la fluorescenciareceptores de neurotransmisores marcado o un componente AZ presináptica se han cuantificado en tres dimensiones con la resolución de una sola sinapsis en C. elegans 22 o el sistema de Drosophila olfativo 23, 24, lo que permite cientos de sinapsis que se caracteriza rápidamente dentro de una sola muestra.
A continuación, presentamos un método por un software de análisis de imagen personalizada de plug-in implementado en un entorno de computación numérica multi-paradigma que permite analizar de forma semiautomática múltiples aspectos de AZS, incluyendo su número, la distribución y el nivel de enriquecimiento de los componentes moleculares de el AZ. Por lo tanto, este análisis complejo nos permitió evaluar la dinámica de los componentes sinápticos en terminales de los axones en diferentes condiciones ambientales. Se investigó el efecto de la exposición a la luz en las sinapsis de salida de los fotorreceptores de moscas adultas. El procedimiento se realiza en tres pasos: 1)preparación para la exposición a la luz, 2) la disección, inmunohistoquímica y microscopía confocal, y 3) el análisis de imágenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, mostramos cómo preparar las condiciones de luz para exponer las moscas a una intensidad de luz igual. Hemos cuantificado no sólo el número de puntos lagrimales sináptica marcador, pero también podríamos resolver espacialmente la densidad de las sinapsis a lo largo de los axones y medir el nivel de deslocalización de la proteína marcadora en zonas citoplasmáticos. Estos tres evaluaciones nos permiten evaluar los detalles de la dinámica sináptica de las neuronas a nivel individual en diferentes…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos a T. Sturner para correcciones votos, discusiones y comentarios sobre el manuscrito; SL Zipursky para proporcionar poblaciones de moscas; M Schölling para tareas de procesamiento. Parte del análisis de imágenes se realizó en el laboratorio de A. Kakita. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alexander von Humboldt y JSP Becas para la Investigación en el Extranjero (AS), JSP Fellows (SH-S.), Grant-In-Ayuda para la puesta en marcha (24800024), en áreas innovadoras (25110713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi Sankyo-, Fundamentos Toray (TS), la financiación básica DZNE (GT) y el Fondo para DZNE Microscopía de Luz (CM).
Materials
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 ml tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
Referências
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