Utarbeidelse og evaluering av^99m Tc-merket tredentat Chelates for Pre-måls Bruke Bioorthogonal kjemi

Summary

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate ^99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Abstract

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing ^99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with ^99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the ^99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Introduction

^99mTc forblir den dominerende radioisotopen benyttes i diagnostisk kjernefysisk medisin, med over 50 millioner avbildningsprosedyrer som utføres hvert år på verdensbasis ^{1, 2, 3.} Flertallet av ^99mTc midler som anvendes klinisk er perfusjon typen radiofarmasøytika. Det er et begrenset antall av aktivt målrettede forbindelser hvor ^99mTc er rettet til å binde en spesifikk biomarkør gjennom ligering til en målretting konstruksjon. Opprettelsen av målrettet ^99mTc radiofarmasøytika er ofte hindret ved påvirkning av ^{99mTc-ligand-kompleksene} på evnen av den målsøkende molekyl for å binde det biomarkør av interesse, eller de isotoper halveringstid er ikke lang nok for bruk med høyere molekylvekt biomolekyler slik som antistoffer. Sistnevnte krever vanligvis flere dager før bildene er ervervet for at biomolekyl å fjerne fra ikke-target tiss verdier. Pre-målretting tilbyr en alternativ tilnærming til å overvinne disse utfordringene.

Pre-målretting kombinert med bioorthogonal kjemi har vist seg å være en effektiv måte for å utvikle nye molekylære avbildnings prober for både fluorescens og radio-avbilding ^{4, 5, 6, 7, 8.} Den inverse elektron krav Diels-Alder (IEDDA) Reaksjonen mellom 1,2,4,5-tetrazine (Tz) og trans -cyclooctene (TCO) derivater, slik som vist i figur 1, har vist seg å være spesielt effektiv ^6. Den IEDDA reaksjon med disse komponentene kan fremvise raske kinetikk i PBS (k ₂ ≈ 6000 M ^-1 s ^-1) og høy selektivitet, noe som gjør den ideell for in vivo pre-målretting applikasjoner ^{9, 10.}

e_content "> Den vanligste tilnærmingen som brukes innebærer å administrere en TCO-avledet målretting vektor og etter en tilstrekkelig forsinkelsesperioden, er en radiomerket tetrazine administreres. Radiomerkede tetraziner basert på ¹¹ C, ¹⁸ F, ⁶⁴ Cu, ⁸⁹ Zr, og ¹¹¹ In har vært rapporterte ^{11, 12, 13, 14, 15.} i motsetning til dette, er det bare en rapport av en ^99m Tc-merket Tz, som ble fremstilt ved anvendelse av en HYNIC typen ligand som krever bruk av ko-ligander for å forhindre proteinbinding og degradering in vivo ^16. som et alternativ, rapporterer vi her syntesen av ^99mTc (i) merket tetraziner ved hjelp av en familie av ligander som danner stabile komplekser med tridentate en ^[99mTc (CO) _3] ⁺ kjerne.

<p class="jove_content" fo:keep-together.within-palder = "en">
Figur 1: bioorthogonal IEDDA reaksjon mellom tetrazine og trans -cyclooctene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Familien av ligander fremstilt inneholde tridentate chelater som varierer i polaritet og arten av bindingsgruppe mellom metall-bindende regionen og den Tz (figur 2). Målet var å identifisere en ^99m Tc-Tetrazine konstruksjon som effektivt kunne lokalisere og reagere med TCO-merkede områder in vivo og raskt klart da ikke er bundet, for å gi høy target-til-ikke-target-forhold. For å teste ligander, ble en TCO-derivat av et bisfosfonat (TCO-BP) brukes ^17. Vi har tidligere vist at TCO-BP lokaliserer til områder med aktiv benmetabolisme og kan reagere medradiomerket tetraziner in vivo ^18. Det er et passende reagens for å teste nye tetraziner, fordi det kan fremstilles i et enkelt trinn og eksperimenter kan utføres i normale mus, hvor lokaliseringen skjer hovedsakelig i leddene (knær og skuldrene).

Protocol

Dyrestudier ble godkjent av forsøksdyretiske styret ved McMaster University i samsvar med Canadian Council on Animal Care (CCAC) retningslinjer. 1. Radiomerking av Tz-tridentate ligander med 99m Tc FORSIKTIG: Følgende prosedyrer krever bruk av radioaktive forbindelser. Arbeidet bør bare gjøres i en lisensiert laboratorium med overholdelse av sikkerhets- og avfallsforskriftene. Mikrobølgeovn reaksjoner bør utføres i en mikrobølgeovn spesiel…

Representative Results

Ligandene ble syntetisert ved hjelp av forskjellige linkere og chelatorer via en enkel reduktiv aminering strategi (figur 2), etterfulgt av kobling av produktet til en kommersielt tilgjengelig tetrazine 22, 23. Radiomerking ble utført ved anvendelse av den samme metode for alle forbindelser og var meget reproduserbar. Prosessen ble optimalisert ved å variere pH, mengden av ligand, reaksjonstid og temperatur, hv…

Discussion

En samling av tetrazine bundet tridentate chelater av ulik polaritet var forberedt, og nytten av sine ^99m Tc komplekser i IEDDA reaksjon med en TCO derivat in vivo ble vurdert. En effektiv og reproduserbar ^99mTc merking metode ble utviklet for fem tetrazine-chelatene, hvor ligandkonsentrasjonen var 10 ^-3 M. markeringstrinn ble etterfulgt av avbeskyttelse av t- butyl-grupper (for forbindelsene 2-5). Den høye konsentrasjonen av ligand ble anvendt for å …

Materials

Argon gas	Alphagaz	—	—
Na2CO3	EMD Millipore	106395	—
Na2B4O7.10H2O	Anachemia	S9640	—
KNaC4H4O6.4H2O	Anachemia	217255	—
Technelite 99mTc generator	Lantheus medical imaging	—	Source of 99mTcO4-
0.9% Saline	Lantheus medical imaging	—	To elute generator
1 M HCl	Lab Chem	—	—
MeOH	Caledon	—	—
ACN	Caledon	—	HPLC grade
Millipore H2O	Thermo Fisher Scientific	Barnstead Nanopure	—
DCM	Caledon	—	—
TFA	Caledon	—	—
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH 7.4 1X
BSA	Sigma Aldrich	A7906	—
Tween80	Sigma Aldrich	P8047	—
Isoflurane	CDMV	108737	Supplier: Fresenius Kabi Animal Health
HPLC	Waters	1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590)	—
HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4	Phenomenex	00G-4435-E0	Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm,
HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5	Waters	186003115	XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm X 100 mm
Microwave Reactor	Biotage	Initiator 8	—
Biotage V10 Evaporator	Biotage	Serial # V1041	—
Dose calibrator	Capintec, Inc.	CRC-25R	—
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard 1470 Automatic Gamma Counter	—
Animal room scale	Mettler Toledo	XP105 Delta Range	—
Microwave vials	Biotage	355629	0.5-2 mL