Isolamento de células endoteliais progenitoras de voluntários saudáveis ​​e seu potencial migratório influenciada por amostras de soro após cirurgia cardíaca

Summary

As células progenitoras endoteliais (CPE) são crucialmente envolvidas na neovascularização de tecidos isquémicos. Este método descreve o isolamento de EPCs humanos a partir de sangue periférico, bem como a identificação do seu potencial migratório contra amostras de soro de pacientes de cirurgia cardíaca.

Abstract

As células progenitoras endoteliais (CPE) são recrutadas a partir da medula óssea em condições patológicas como a hipóxia e são crucialmente envolvidas na neovascularização de tecidos isquémicos. A origem, classificação e caracterização de EPCs são complexas; Não obstante, dois sub-tipos importantes de EPCs foram estabelecidas: os chamados "early" EPCs (posteriormente referido como primeiros-EPCs) EPCs e tardio-excrescência (late-EPCs). Eles podem ser classificados pelo propriedades biológicas, bem como pela sua aparência durante a cultura in vitro. Enquanto EPCs "precoces" aparecem em menos de uma semana depois de a cultura de células mononucleares derivadas de sangue periférico em meios-CE específico, EPCs de fim de conseqüência pode ser encontrado após 2-3 semanas. EPCs Late-desdobramento ter sido reconhecido como estando directamente envolvido na neovascularização, principalmente através da sua capacidade de se diferenciar em células endoteliais maduras, enquanto que "cedo" EPCs expressar vários fatores angiogênicos como endógenaous carga para promover a angiogénese de um modo parácrino. Durante miocárdio a isquemia / reperfusão (I / R), vários factores controlar o homing de CPE para as regiões de formação de vasos sanguíneos.

Factor de inibição de migração de macrófagos (MIF) é uma citocina pró-inflamatória e ubiquamente expresso quimiocina-e como foi recentemente descrito como a função do regulador chave da migração EPCs em concentrações fisiológicas ^1. Curiosamente, MIF é armazenado em piscinas intracelulares e pode rapidamente ser liberado na corrente sanguínea após vários estímulos (por exemplo, enfarte do miocárdio).
Este protocolo descreve um método para o isolamento seguro e cultura de início-EPCs a partir de sangue periférico humano adulto com base na selecção de células CD34-positivas com a cultura subsequente em meio contendo factores de crescimento endoteliais em placas revestidas com fibronectina para utilização em ensaios in vitro de migração contra amostras de soro dos pacientes cirúrgicos cardíacos. Além disso, oinfluência migratória de MIF em quimiotaxia de EPCs em comparação com outras citocinas de estimulação de angiogénese bem conhecido é demonstrada.

Introduction

As células progenitoras endoteliais (CPE) estão em circulação no sangue humano e têm a capacidade de se diferenciarem em células endoteliais ^2. Eles participam na vasculogénese e são capazes de minimizar o dano causado por ferimentos inflamação e isquemia / reperfusão (I / R) de várias ^{maneiras, 3 4.} Por exemplo, EPCs mostram níveis elevados de enzimas antioxidantes intracelular, tal como a catalase, glutationa peroxidase ou superóxido dismutase de manganês (MnSOD) ^5. A elevada resistência contra o estresse oxidativo permite EPCs para funcionar em microambientes com espécies elevados reactivas de oxigénio (ROS) após a lesão isquêmica ^6. Estudos anteriores indicaram que também o número de CPE pode ser correlacionada com a reparação vascular e que um número reduzido de circulantes EPCs prevê a ocorrência de eventos cardiovasculares ^7,class = "xref"> 8. No entanto, uma definição clara de um EPC ainda não foi encontrado. Até agora, não existe um marcador da superfície celular específico ou fenótipo consistente para CPE e estas células são muito raros no sangue periférico ^9. Um EPC humana deve ser considerada como uma célula de circulação com a capacidade de contribuir para a reconstrução do endotélio lesionado e novas estruturas vasculares.

Uma maneira de isolar e caracterizar EPCs é através da adesão à fibronectina. Deste modo, a capacidade destas células é utilizado para mostrar uma aderência superior à fibronectina pratos revestidos em comparação com um tipo de colagénio, por exemplo, ^{3, 10, 11.} No entanto, outros descobriram que o plaqueamento de células mononucleares em pratos revestidos com fibronectina sem qualquer passo de purificação anterior ou ainda leva a colónias incluindo células progenitoras mielóides, monócitos e linfócitos T ^{12, 13, 14.} Além disso, neste caso, as plaquetas podem contaminar a fracção de células mononucleares (MNC) e transferir, assim, proteínas de membrana de plasma de todas as células aderentes ^15.

Além da caracterização através de ensaios in vitro de adesão, uma combinação de diferentes marcadores de superfície de células é utilizado para descrever um tipo de célula considerado como um EPC. Neste caso, após a adesão mediada por fibronectina, as células são analisadas quanto ao atributos de tipo endotelial. Neste processo, os dois marcadores associados às células endoteliais, de lipoproteínas acetiladas de baixa densidade (AcLDL) e vascular do receptor do factor de crescimento endotelial 2 (VEGFR-2, KDR), desempenham um papel. As células endoteliais e macrófagos foram mostrados para tomar-se especificamente AcLDL em um processo chamado de "via celular sequestrante" ^16. Outra proteína marcadora é KDR como o principal receptor de VEGF em endotelialAs células ^17. No entanto, como EPCs em geral, são cultivadas em meio suplementado com factores de crescimento endoteliais e soro fetal de vitela, é possível que os macrófagos, que também pode ter sido erroneamente isolado, exibem um perfil de marcadores de tipo endotelial. Como foi mostrado anteriormente, se cultivadas em um meio com ar-endotelial, macrófagos expressam proteínas "específico-endoteliais" ^18.

Em geral, existem duas categorias de EPCs dentro mais subtipos, os quais podem ser encontrados no sangue ou ser cultivadas in vitro. EPCs final-excrescência (late-EPCs) aparecem após 2-3 semanas de cultura. Estas células são integrados mais rápido para uma monocamada de células endoteliais da veia umbilical humana e pode formar tubos capilares ^19. Além disso, os chamados "Early-EPCs" circulam no sangue para cerca de uma semana e agir de uma maneira mais passiva através da realização moléculas angiogénicas, tais como crescimento endotelial vascularfator (VEGF), ou CXCL8 ^19. Os pacientes com doença arterial coronariana (DAC) mostrou valores significativamente mais baixos de early-EPCs em comparação a um grupo controle sem DAC ^20. Curiosamente, o mesmo grupo demonstrou valores mais elevados de final-EPCs em comparação com um grupo de controlo. Outro estudo mostrou que early-EPCs proteger CPE diferenciadas da apoptose em condições oxidantes, de uma forma parácrina ^6. Portanto, os primeiros EPCs pode proporcionar efeitos protectores relevantes através da migração de outras células de uma forma automática ou parácrina dentro do sangue periférico.

Este protocolo descreve um método para purificar primeiros-EPCs em primeiro lugar isolar as PBMC-fracção a partir de sangue periférico humano e, subsequentemente, isolar as células CD34 ⁺ a partir de PBMC-fracção para limpar esta suspensão de células a partir de células não desejadas. O CD34 é um marcador, o qual é utilizado para o isolamento de células-tronco hematopoiéticas humanas ⁹ </sup>. Em seguida, as células CD34 ⁺ são cultivadas em superfícies de cultura de tecidos revestidas com f ibronectina. Depois de três dias, o meio é mudado, perdendo assim todas as células não-aderentes. Finalmente, CPE isoladas são coradas para verificar a absorção de AcLDL e a presença de células endoteliais como KDR-marcador usando células activadas por fluorescência (FACS). Como um marcador adicional, analisamos molécula endotelial de adesão celular das plaquetas (PECAM-1, CD31), que também ocorre em células endoteliais.

Restauração do tecido do miocárdio danificado ou infartados pela maior recrutamento de EPCs pertence às estratégias de tratamento intensamente investigadas em doenças cardiovasculares. No entanto, a tradução de resultados experimentais para a prática clínica é ainda difícil, dado o complexo interacção celular no corpo humano durante várias condições fisiopatológicas. Além disso, o miocárdio I / R lesões desencadear uma secreção excessiva de diversas citoquinas, hormonas e FAC crescimento res, que controlam a homing de EPCs a regiões de formação de vasos sanguíneos ^13. Tal como já foi mostrado, CXCL8, derivado de células do estroma fator 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF e factor inibidor da migração de macrófagos (MIF) estão significativamente aumentados em amostras de soro após lesão miocárdica de I / R ^1. Entre esses fatores, MIF é uma citocina quimiocinas-like pleiotropic com características predominantemente pró-inflamatórias. Em contraste com o seu nome histórico, MIF tem funções pró-migratórios, actuando como uma verdadeira quimiocina em vários tipos de células de ^{1, 21, 22.} Processos de recrutamento celular de MIF-mediadas foram ligados ao receptores de quimioquinas CXCR4 e CXCR2, que MIF se liga e activa de uma forma não-cognato ^21. De nota, EPCs expressar ambos estes receptores na sua superfície, o qual, adicionalmente, tornam-se-reguladas sob condições hipóxicasass = "xref"> ^{23, 24.} Além disso, evidências acumuladas sugerem que MIF tem um efeito global cardio-protector durante a lesão de I / R do coração ^{22, 25, 26.} Neste contexto, foi ainda demonstrado que MIF pode apoiar a neovascularização durante o estresse hipóxico que é de particular relevância, quando se analisam os mecanismos de recuperação limitadas do miocárdio lesado ^27. Anteriores estudos in vitro e experiências em modelos pré-clínicos de rato fornecida primeira evidência sobre o papel da MIF no EPCs recrutamento ^4. De nota, MIF também é uma proteína de carga proeminente de EPCs que pode ser introduzida durante o recrutamento EPCs dentro de sites isquêmicas ^28. No entanto, estudos em ambientes clínicos, em especial em comparação com outros (angiogênicas) citocinas séricas permanecem ainda desconhecidos.

Protocol

Sangue para o isolamento de EPCs foi obtido de voluntários saudáveis ​​após consentimento informado, de acordo com o comitê de ética local. As amostras de soro usados ​​nos ensaios de migração foram obtidas de pacientes submetidos à cirurgia cardíaca convencional com o uso de circulação extracorpórea (CEC). Os critérios de exclusão foram operações de emergência, gravidez conhecida ou suspeita, do doente idade inferior a 18 anos, e falha na obtenção de consentimento informado. As amostras de so…

Representative Results

Caracterização de isolados células endoteliais progenitoras Em primeiro lugar, a absorção de AcLDL foi verificado, bem como a expressão de KDR, e CD31 sobre a superfície da população de células isoladas. Como mostra a figura 7A, 85,1% dos EPCs isoladas mostrou uma absorção de AcLDL e expressou CD31. As Figuras 7b e 7c mostram, adicionalmente, uma distribuição homog?…

Discussion

A primeira parte deste estudo incluiu o isolamento de EPCs humanos do sangue periférico de voluntários saudáveis ​​para permitir uma avaliação completa do sangue de pacientes de cirurgia cardíaca. Portanto, uma centrifugação em gradiente de densidade foi realizada para separar a fracção de PBMC a partir de plasma, granulócitos e eritrócitos. Para remover a maioria dos contaminantes plaquetas, célula esta fracção foi submetida a curto e lavagem lenta os passos ^29, <su…

Materials

Fibronectin	Biochrom AG	L7117	Coating of T-75 flasks
Aqua ad iniectabilia	Fresenius Kabi
Endothelial cell growth medium MV2	Promo Cell	C-22221
Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix	Promo Cell	C-39226
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	17-1440-03	Density centrifugation
EasySep human CD34 positive Selection Kit	Stemcell Technologies	18056	Isolation of CD34+ cells
EasySep magnet	Stemcell Technologies	18000
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Detachment of cells
Corning HTS transwell 96 well permeable supports	Sigma-Aldrich	CLS3387-8EA	Migration system
Hoechst solution	ThermoFisher	33342	Staining of migrated cells
ImageJ	National institutes of health	xxx	Counting of migrated cells