Isolering av Endothelial stamceller från friska frivilliga och flyttning Potential Influenser serumprover efter hjärtkirurgi

Summary

Endotelceller progenitorceller (EPC) är avgörande inblandade i kärlnybildning av ischemiska vävnader. Denna metod beskriver isolering av mänskliga EPC från perifert blod, liksom fastställandet av deras migrations potential mot serumprover av hjärt kirurgiska patienter.

Abstract

Endotelceller progenitorceller (EPC) rekryteras från benmärgen i patologiska tillstånd som hypoxi och avgörande inblandade i kärlnybildning av ischemiska vävnader. Ursprunget, klassificering och karakterisering av EPC är komplexa; Trots har två framstående subtyper av EPCs fastställts: så kallade "tidiga" EPC (nedan kallad tidig-EPC) och sent utväxt EPC (sent EPC). De kan klassificeras med biologiska egenskaper liksom av deras utseende under in vitro kultur. Medan "tidiga" EPC visas i mindre än en vecka efter odling av perifera blodhärledda mononukleära celler i EG-specifika medier, kan sen utväxt EPC hittas efter 2-3 veckor. Sen utväxt EPC har erkänts vara direkt involverade i kärlnybildning, främst genom sin förmåga att differentiera till mogna endotelceller, medan "tidiga" EPC uttrycka olika angiogena faktorer som Endogengare last för att främja angiogenes på ett parakrint sätt. Under ischemi / reperfusion (I / R), olika faktorer styr målsökande av EPC till regioner av blodkärlsbildning.

Migration av makrofager hämmande faktor (MIF) är en kemokin liknande pro-inflammatoriska och allmänt utbrett uttryckt cytokin och beskrevs nyligen att fungera som nyckelregulator för EPC migration vid fysiologiska koncentrationer ^1. Intressant är MIF lagras i intracellulära pooler och kan snabbt släppas ut i blodet efter flera stimuli (t.ex. hjärtinfarkt).
Detta protokoll beskriver en metod för tillförlitlig isolering och odling av tidiga-EPCs från vuxen human perifert blod baserat på CD34-positiv selektion med efterföljande odling i medium innehållande endoteliala tillväxtfaktorer på fibronektinbelagda plattor för användning i in vitro-migrationsanalyser mot serumprover av hjärt kirurgiska patienter. Dessutommigratory påverkan av MIF på kemotaxi av EPCs jämfört med andra välkända angiogenesstimulerande cytokiner demonstreras.

Introduction

Endoteliala progenitorceller (EPC) cirkulerar i humant blod och har förmågan att differentiera till endotelceller ^2. De deltar i vaskulogenes och har förmåga att minimera de skador som orsakas av inflammation och ischemi / reperfusion (I / R) skador på olika sätt ^{3, 4.} Till exempel, EPC visar förhöjda halter av intracellulära antioxidantenzymer som katalas, glutationperoxidas eller mangan superoxiddismutaser (MnSOD) ^5. Den förhöjda motstånd mot oxidativ stress kan EPC att fungera i mikromiljöer med förhöjda reaktiva syreradikaler (ROS) efter ischemisk skada ^6. Tidigare studier visade också att antalet EPC kan korreleras till vaskulär reparation och att ett minskat antal cirkulerande EPC förut förekomsten av kardiovaskulära händelser ^7,class = "xref"> 8. Emellertid har en tydlig definition av en EPC inte hittats ännu. Hittills finns det ingen särskild cellytan markör eller konsekvent fenotyp för EPC och dessa celler är mycket sällsynta i det perifera blodet ^9. En mänsklig EPC bör betraktas som ett cirkulerande cell med förmåga att bidra till återuppbyggnaden av den skadade endotel och nya kärlstrukturer.

Ett sätt att isolera och karakterisera EPC är genom vidhäftning till fibronektin. Därigenom är förmågan hos dessa celler används för att visa en överlägsen vidhäftning till fibronektin belagda rätter jämfört med typ 1 kollagen, till exempel ^{3, 10, 11.} Men andra fann att plätering mononukleära celler på fibronektinbelagda rätter utan någon föregående eller ytterligare reningssteg leder till kolonier inklusive myeloida progenitorceller, monocyter och T-lymfocyter ^{12, 13, 14.} Dessutom, i detta fall, kan trombocyter förorena mononukleära cell (MNC) fraktionen och därmed överföra plasmamembranproteiner till eventuella vidhäftande celler ^15.

Förutom karakterisering genom in vitro-vidhäftningsanalyser, är en kombination av olika markörer på cellytan som används för att beskriva en celltyp betraktas som en EPC. I detta fall, efter fibronektin-förmedlad vidhäftning, cellerna analyseras angående deras endotel-liknande attribut. I denna process, de två endoteliala cellassocierade markörer, acetylerad-lågdensitetslipoprotein (AcLDL) och vaskulär endotelial tillväxtfaktorreceptor 2 (VEGFR-2, KDR), spela en roll. Endotelceller och makrofager har visat sig särskilt ta upp AcLDL i en process som kallas "renhållare cellvägen" ^16. En annan markörproteinet är KDR som huvud VEGF-receptor på endotelcellerceller ^17. Emellertid, som EPCs i allmänhet odlas i media som kompletterats med endoteliala tillväxtfaktorer och fetalt kalvserum, är det möjligt att makrofager, som kanske även har felaktigt isolerade, uppvisar en endotel-liknande markör profil. Som tidigare visats, om odlas i ett endotel-konditionerat medium, makrofager uttrycker "endotelceller specifika" proteiner ^18.

I allmänhet finns det två kategorier av EPCs inom flera subtyper, vilka återfinns i blodet eller odlas in vitro. Sena-utväxt EPC (sent EPC) visas efter 2-3 veckors odling. Dessa celler är integrerade snabbare i ett monoskikt av humana navelvenendotelceller och kan bilda kapillärrör ^19. Dessutom, så kallade "early-EPCs" cirkulerar i blodet i ungefär en vecka och agera på ett mer passivt sätt genom att leverera angiogena molekyler, såsom vaskulär endotelial tillväxtfaktor(VEGF), eller CXCL8 ^19. Patienter med kranskärlssjukdom (CAD) uppvisade signifikant lägre halter av tidiga-EPCs jämfört med en kontrollgrupp utan CAD ^20. Intressant nog visade samma grupp högre mängder av sena-EPCs jämfört med en kontrollgrupp. En annan studie visade att tidig EPC skydda differentierade EPC från apoptos under oxidativa förhållanden parakrin sätt ^6. Därför kan tidiga EPC ge relevanta skyddande effekter genom migration av andra celler i en auto- eller parakrina sätt i det perifera blodet.

Detta protokoll beskriver en metod för att rena tidiga-EPCs genom att först isolera PBMC-fraktionen från humant perifert blod och därefter isolera CD34 ⁺ celler från PBMC-fraktionen för att rensa denna cellsuspension från oönskade celler. CD34 är en markör, som används för isoleringen av humana hematopoietiska stamceller ⁹ </sup>. Efteråt, CD34 ⁺ celler odlas på fibronektinbelagda vävnadsodlingsytor. Efter tre dagar, byts mediet och därmed förlora alla icke-vidhäftande celler. Slutligen är isolerade EPCs färgas för att kontrollera upptagningen av AcLDL och närvaron av KDR som endotelial cellmarkör genom användning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Som en ytterligare markör, analyserade vi blodplätts endotelial celladhesionsmolekyl (PECAM-1, CD31), som också förekommer på endotelceller.

Restaurering av skadade eller infarkthjärtmuskelvävnaden genom ökad rekrytering av EPC hör till de intensivt undersökta behandlingsstrategier i hjärt- och kärlsjukdomar. Det är dock fortfarande en utmaning översättning av experimentella resultat i klinisk praxis, med tanke på den komplexa cellulära samspelet i människokroppen under olika patofysiologiska förhållanden. Dessutom myocardial I / R skador utlöser en överdriven utsöndring av olika cytokiner, hormoner och tillväxt FAC torer, som styr målsökande av EPCs till regioner i blodkärlsbildning ^13. Som redan visats, CXCL8, stromal derived faktor 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF och migration av makrofager hämmande faktor (MIF) är signifikant ökad i serumprov efter hjärtinfarkt I / R skada ^en. Bland dessa faktorer, är MIF en pleiotrop kemokin liknande cytokin med övervägande pro-inflammatoriska egenskaper. I motsats till dess historiska namn, har MIF pro-flyttande funktioner, i egenskap av en sann kemokin på olika celltyper ^{1, 21, 22.} MIF-medierade cellrekryteringsprocesser har varit kopplade till kemokinreceptorer CXCR2 och CXCR4, vilket MIF binder till och aktiverar på ett icke-besläktat sätt ^21. Notera EPC uttrycka båda dessa receptorer på sin yta, som dessutom blir uppregleras under hypoxiska betingelserass = "xref"> ^{23, 24.} Dessutom föreslår ackumulera bevis för att MIF har en övergripande hjärt-skyddande effekt under I / R skada av hjärtat ^{22, 25, 26.} I detta sammanhang har det visat sig vidare att MIF kan stödja kärlnybildning under hypoxisk stress som är av särskild betydelse, när man överväger de begränsade mekanismerna för återvinning av skadade hjärtmuskeln ^27. Tidigare in vitro-studier och experiment i prekliniska musmodeller tillhandahålls första bevis om rollen av MIF i EPC rekrytering ^4. Notera, är MIF också en framträdande last protein av EPC som får släppas ut under EPC rekrytering inom ischemiska platser ^28. Men studier i kliniska inställningar, särskilt i jämförelse med andra (angiogena) serum cytokiner förblir gäckande.

Protocol

Blod för isolering av EPC erhölls från friska frivilliga efter informerat samtycke i enlighet med den lokala etiska kommittén. Serumprover som användes i migrationsanalyser erhölls från patienter som genomgick konventionell hjärtkirurgi med användning av hjärt-lungbypass (CPB). Uteslutningskriterier var katastrofinsatser, känd eller misstänkt graviditet, patient`s ålder mindre än 18 år, och misslyckas med att erhålla informerat samtycke. Serumprover togs utöver kliniska rutinmätningar (omedelbart före…

Representative Results

Karakterisering av isolerade endoteliala progenitorceller Först upptaget av AcLDL kontrolleras, liksom uttrycket av KDR, och CD31 på ytan av den isolerade cellpopulationen. Som Figur 7a visar, 85,1% av de isolerade EPC visade ett upptag av AcLDL och uttryckte CD31. Figurerna 7b och 7c visar vidare en homogen fördelning av båda markörerna, även om det verkar vara en mindre b…

Discussion

Den första delen av denna studie ingick isolering av mänskliga EPC från perifert blod från friska frivilliga för att möjliggöra en omfattande utvärdering av blod hjärtkirurgpatienter. Därför gjordes en densitetsgradient centrifugering utförs för att separera den PBMC-fraktionen från plasma, granulocyter och erytrocyter. Att avlägsna det mesta av de kontamine trombocyter, var detta cellfraktionen utsattes för kort och långsamma tvättningssteg ^{29, 30.<…}

Materials

Fibronectin	Biochrom AG	L7117	Coating of T-75 flasks
Aqua ad iniectabilia	Fresenius Kabi
Endothelial cell growth medium MV2	Promo Cell	C-22221
Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix	Promo Cell	C-39226
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	17-1440-03	Density centrifugation
EasySep human CD34 positive Selection Kit	Stemcell Technologies	18056	Isolation of CD34+ cells
EasySep magnet	Stemcell Technologies	18000
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Detachment of cells
Corning HTS transwell 96 well permeable supports	Sigma-Aldrich	CLS3387-8EA	Migration system
Hoechst solution	ThermoFisher	33342	Staining of migrated cells
ImageJ	National institutes of health	xxx	Counting of migrated cells