मानव Pluripotent स्टेम सेल से आदिम और निश्चित टेम Progenitors के विभेद का निर्देशन
Summary
यहां, हम वर्तमान मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC) संस्कृति प्रोटोकॉल, CD34 में hPSCs अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया+ टेम progenitors । यह विधि या तो निश्चित या आदिम टेम प्रोग्राम करने के लिए विशेष रूप से कक्षों को निर्दिष्ट करने के लिए विहित WNT संकेतन के चरण-विशिष्ट हेरफेर का उपयोग करता है ।
Abstract
reअपक्षयी दवा के लिए प्रमुख लक्ष्यों में से एक पीढ़ी और टेम स्टेम सेल (HSCs) मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) से व्युत्पंन का रखरखाव है । हाल ही में जब तक, HSCs में hPSCs अंतर करने के प्रयासों को मुख्य रूप से उत्पंन टेम progenitors कि क्षमता HSC कमी है, और बजाय जर्दी थैली hematopoiesis जैसा दिखता है । इन के परिणामस्वरूप टेम progenitors के लिए सीमित उपयोगिता हो सकती है इन विट्रो रोग विभिंन वयस्क टेम विकारों के मॉडलिंग, विशेष रूप से लसीकावत् वंश के उन । लेकिन, हम हाल ही में एरतरो उत्पंन करने के तरीके वर्णित है-myelo-लसीकावत् multilineage निश्चित टेम progenitors से hPSCs एक मंच का उपयोग विशिष्ट भेदभाव प्रोटोकॉल, जो हम यहां रूपरेखा का प्रयोग । तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित plasticware पर hPSCs के एंजाइमी पृथक्करण के माध्यम से, embryoid निकायों (EBs) का गठन कर रहे हैं । EBs संयोजक BMP4, जो बाद में टेम अवरोध करनेवाला, GSK3β द्वारा निश्चित CHIR99021 कार्यक्रम के लिए निर्दिष्ट है द्वारा त्वक को विभेदित कर रहे हैं । वैकल्पिक रूप से, आदिम hematopoiesis PORCN अवरोध करनेवाला, IWP2 द्वारा निर्दिष्ट है । Hematopoiesis आगे संयोजक वीईजीएफ़ और सहायक टेम साइटोकिंस के अलावा के माध्यम से संचालित है । परिणामस्वरूप टेम progenitors इस विधि का उपयोग कर उत्पन्न रोग और विकासात्मक मॉडलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है, इन विट्रो में.
Introduction
मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) दोनों मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESCs) और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) को शामिल के रूप में परिभाषित कर रहे हैं, और न केवल आत्म से गुजर उचित विकास की स्थिति के तहत नवीकरण की अद्वितीय क्षमता है, लेकिन यह भी, क्षमता सभी प्रकार के कोशिका में अंतर करने के लिए तीन रोगाणु परतों से व्युत्पंन: अन्तः, त्वक, और बाह्यत्वक1। इन अद्वितीय क्षमताओं के कारण, hPSCs अपक्षयी दवा के लिए महान वादा पकड़, रोग मॉडलिंग, और कोशिका-आधारित चिकित्सा2. जबकि एकाधिक कोशिका प्रकार सफलतापूर्वक hPSCs से विभेदित किया गया है, एक महत्वपूर्ण चुनौती है विशेष रूप से वयस्क की तरह hPSC-व्युत्पंन टेम स्टेम सेल (HSCs) और निश्चित टेम progenitors के इन विट्रो विनिर्देशन में ।
एक hPSCs से मानव HSCs के विकास के लिए संभावना बाधा मानव भ्रूण के भीतर कई टेम कार्यक्रमों की उपस्थिति है3। पहला प्रोग्राम जो उभर रहा है, “आदिम hematopoiesis,” extraembryonic जर्दी थैली ऊतक के भीतर होता है और सबसे अच्छा erythroblast progenitors (EryP-सीएफसी), मैक्रोफेज, और megakaryocytes के अपने क्षणिक उत्पादन की विशेषता है । विशेष रूप से, इस कार्यक्रम HSCs को जंम देना नहीं है, न ही यह टी और बी लसीकावत् progenitors को जंम दे । हालांकि, जर्दी थैली क्षणिक इस तरह एरतरो-माइलॉयड जनक (EMP4,5,6,7,8) के रूप में प्रतिबंधित निश्चित टेम progenitors, वृद्धि दे करता है और erythroid-आपुर्ति लसीकावत्-प्रधानमन्त्री multipotent जनक (LMPP९) । हालांकि, न तो EMPs और न ही LMPPs पूरी तरह से multipotent हैं, या वयस्क प्राप्तकर्ताओं में HSC-like engraftment में सक्षम हैं । इसके विपरीत, बाद में विकास में, प्रतिष्ठित परिभाषित “निश्चित” टेम कार्यक्रम महाधमनी में निर्दिष्ट किया गया है-gonad भ्रूण के mesonephros क्षेत्र उचित, टेम सहित सभी वयस्क HSC वंश को जंम दे रही है । इन अंतर भ्रूण निश्चित टेम कोशिकाओं के विनिर्देशन एक पायदान पर निर्भर फैशन में होता है, एक endothelial के माध्यम से-टेम संक्रमण hemogenic endothelium से (वह)3,10,11 ,12,13,14. एक तरफ पुनर्गठन क्षमता, multilineage क्षमता और पायदान-निर्भरता इन कोशिकाओं की EMP और LMPP से इन निश्चित टेम progenitors भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (सन्दर्भ में समीक्षित3,13 ).
तंत्र (ओं को समझना) hPSCs से आदिम और निश्चित टेम विनिर्देश शासी progenitors लाइनों की एक किस्म भर में निश्चित टेम hPSC के प्रतिलिपि उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है । हाल ही में जब तक, hPSC भेदभाव प्रोटोकॉल है कि अलग सकता है multipotent आदिम और निश्चित टेम progenitors मौजूद नहीं था15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. कई भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और/या stromal सह संस्कृति का उपयोग कर दृष्टिकोण पहले hPSC भेदभाव की टेम क्षमता रेखांकित, आदिम और निश्चित टेम संभावित15,16के मिश्रण के साथ, 17,19,22,23,25. इसके अलावा, कई सीरम मुक्त टेम प्रोटोकॉल hPSCs से त्वक के विनिर्देशन के लिए संकेत आवश्यकताओं का वर्णन किया है कि बंदरगाह टेम संभावित18,20,21, 24. हालांकि, इन तरीकों के रूप में अभी भी दोनों कार्यक्रमों के विषम मिश्रण को जंम दिया, नैदानिक अनुप्रयोगों में उनके उपयोग और विकास तंत्र को समझने सीमित किया जा सकता है ।
हम हाल ही में इन अध्ययनों पर बनाया गया है, ACTIVIN/नोडल और WNT से आदिम और निश्चित टेम विनिर्देशन में संकेतन के लिए मंच विशिष्ट संकेत आवश्यकताओं को रेखांकित कर-व्युत्पंन त्वक18,26 . बाद विशेष रूप से अनूठा था, मंच के अपने प्रयोग के रूप में विशिष्ट WNT संकेत हेरफेर या तो विशेष रूप से आदिम या विशेष रूप से निश्चित टेम progenitors26के विनिर्देशन के लिए अनुमति देता है । त्वक विनिर्देश के दौरान, विहित WNT के निषेध PORCN अवरोधक के साथ संकेतन CD43 के विनिर्देशन में IWP2 परिणाम+ EryP-सीएफसी और माइलॉयड progenitors, कोई जासूसी लसीकावत् क्षमता के साथ । इसके विपरीत, विहित WNT की उत्तेजना GSK3β अवरोध करनेवाला के साथ संकेतन, CHIR99021, विभेद के एक ही चरण के दौरान detectable CD43 के पूर्ण अभाव में हुई+ EryP-सीएफसी, जबकि एक साथ करने के लिए अग्रणी CD34+CD43− के विनिर्देशन । इस आबादी के पास माइलॉयड, HBG-एक्सप्रेस erythroid, और टी-लसीकावत् क्षमता । बाद में विश्लेषण इस वह CD73 की अभिव्यक्ति की कमी के रूप में की पहचान की27,28 और CD18428, और उसके टेम क्षमता पायदान पर निर्भर28था । इसके अलावा, एकल सेल क्लोनल विश्लेषण का प्रदर्शन किया है कि इन निश्चित टेम वंश multipotent एकल कोशिकाओं से प्राप्त हो सकता है28। एक साथ ले लिया, इन अध्ययनों से संकेत मिलता है कि चरण-विशिष्ट WNT संकेत हेरफेर या तो शुद्ध आदिम टेम progenitors, या multipotent पायदान निर्भर निश्चित टेम progenitors निर्दिष्ट कर सकते हैं ।
यहां, हम अपने भेदभाव की रणनीति रूपरेखा कि पैदावार विशेष रूप से आदिम या निश्चित टेम progenitors, विहित WNT mesodermal patterning के दौरान संकेतन के हेरफेर के द्वारा, और उनके बहाव टेम वंश परख । इस प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं जो या तो आदिम या निश्चित टेम progenitors के hPSCs से अपक्षयी दवा अनुप्रयोगों के लिए के उत्पादन में रुचि रखते है के लिए महान मूल्य की है ।
Protocol
1. रिएजेंट सेल लाइंस; hESCs या hiPSCs 1 , माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) 29 , OP9-DL4 स्ट्रोमा 30 , ३१ . रिएजेंट वडा पंजाबियों में जिलेटिन की ०.?…
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक तेजी से, सीरम मुक्त, या तो आदिम या निश्चित टेम progenitors के भेदभाव के लिए स्ट्रोमा मुक्त विधि । या तो आदिम या निश्चित टेम progenitors की Mesodermal विनिर्देश मज़बूती से हमारे प्रोटोकॉल है, जो विशिष्?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम आंतरिक चिकित्सा विभाग, रुधिर के प्रभाग, वाशिंगटन विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन द्वारा समर्थित किया गया है । सीडी राष्ट्रीय हार्ट, फेफड़े, और रक्त संस्थान से T32HL007088 द्वारा समर्थित किया गया था । सीएमएस एक अमेरिकी रुधिर विद्वान पुरस्कार के समाज का समर्थन किया था ।
Materials
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) | Corning | 10-016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated | Gemini Bioproducts | 100-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Gelatin, porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Alpha-MEM | Life Technologies | 12000-022 | |
| DMEM-F12 | Corning | 10-092-CV | |
| Knock-out serum replacement | Life Technologies | 10828028 | "KOSR" |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| b-mercaptoethanol, 55 mM solution | Life Technologies | 21985023 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Fraction V, Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605 | |
| Ham's F12 | Corning | 10-080 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| B27 supplement, no vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Stempro-34 (SP34) | Life Technologies | 10639011 | "SP34" |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 354230 | "MAT" |
| L-absorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human serum transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagenase II | Life Technologies | 17101015 | |
| DNaseI | Calbiochem | 260913 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| IL-6 | R&D Systems | 206-IL | |
| IL-7 | R&D Systems | 207-IL | |
| IL-11 | R&D Systems | 218-1L | |
| TPO | R&D Systems | 288-TP | |
| EPO | Peprotech | 100-64 | |
| Flt-3 ligand (FLT3-L) | R&D Systems | 308-FK | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| IWP2 | Tocris | 3533 | |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Losartan Potassium | Tocris | 3798 | |
| CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 | BD Biosciences | 560650 | Dilution 1:100; T cell assay |
| CD8 PE Clone RPA-T8 | BD Biosciences | 561950 | Dilution 1:10; T cell assay |
| CD34 APC Clone 8G12 | BD Biosciences | 340441 | Dilution 1:100; EHT assay |
| CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 | BD Biosciences | 348801 | Dilution 1:100; Hemogenic endothelium |
| CD43 FITC Clone 1G10 | BD Biosciences | 555475 | Dilution 1:10; Hemogenic endothelium |
| CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 | BD Biosciences | 557833 | Dilution 1:50; T cell assay |
| CD45 eFluor450 Clone 2D1 | BD Biosciences | 642284 | Dilution 1:50; EHT assay |
| CD56 APC Clone B159 | BD Biosciences | 555518 | Dilution 1:20; T cell assay |
| CD73 PE Clone AD2 | BD Biosciences | 550257 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| CD184 APC Clone 12G5 | BD Biosciences | 555976 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | BD Biosciences | 564907 | Dilution 1:10,000; T cell assay |
| OP9 DL4 cells | Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156 | ||
| MethoCult H4034 | Stemcell Technologies | 4034 | "MeC" |
| Milli-Q water purification system | EMD Millipore | ||
| 5% CO2 incubator | Set at 37 C | ||
| Multigas incubator | Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2 | ||
| 6 well tissue culture plate | Corning | 353046 | |
| 24 well tissue culture plate | Corning | 353226 | |
| 6 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3471 | |
| 24 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| 35 mm tissue culture dishes | Corning | 353001 | |
| Blunt-end needle, 16 gauge | Corning | 305198 | |
| 3 cc syringes | Corning | 309657 | |
| 5 mL polypropylene test tube | Corning | 352063 | |
| 5 mL polystyrene test tube | Corning | 352058 | |
| 15 mL polypropylene conical | Corning | 430791 | |
| 50 mL polypropylene conical | Corning | 430921 | |
| 2 mL serological pipette | Corning | 357507 | |
| 5 mL serological pipette | Corning | 4487 | |
| 10 mL serological pipette | Corning | 4488 | |
| 25 mL serological pipette | Corning | 4489 | |
| Cell scrapers | Corning | 353085 | |
| 2.0 mL cryovials | Corning | 430488 | |
| 5 mL test tube with 40 µM cell strainer | Corning | 352235 | |
| 40 µM cell strainer | Corning | 352340 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Biosafety hood | |||
| FACS AriaII or equivalent | |||
| LSRii or equivalent | |||
| FlowJo software | TreeStar | ||
| Water bath | Set at 37 C | ||
| 0.22 µM filtration system | Corning | ||
| Autoclave | |||
| 4 C refrigerator | |||
| -20 C Freezer | |||
| -80 C Freezer |
Referências
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