Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות
Summary
אנו מציגים במחקר הנוכחי הוא assay קרינה מבוססת רומן באמצעות לימפוציטים נגזר עכבר מהונדס. Assay זה מתאים להקרנה תפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות קטנות ניחן קיבולת אחד עיכוב או קידום ההפעלה הלימפוציטים.
Abstract
הקרנת תפוקה גבוהה (HTS) היא כיום התווך לזיהוי ישויות כימיות מסוגלות ויסות תגובות ביוכימיות או תהליכים תאיים. עם ההתקדמות ביוטכנולוגיות ופוטנציאל translational הגבוהה של מולקולות קטנות, מספר גישות חדשניות גילוי סמים התפתחו, מה שמסביר את העניין המתחדשת בשימוש HTS. לתחום הסרטן הוא כיום תחום המחקר הפעיל ביותר עבור הקרנה בסמים, ללא פריצת דרך משמעותית עשויה לזיהוי תרכובות אימונו החדשים מיקוד סיבוכים הקשורים להשתלה או מחלות אוטואימוניות. כאן, אנו מציגים רומן assay הלימפוציטים פלורסנט המבוסס murine במבחנה להתאים בקלות לזיהוי תרכובות אימונו-חדשות. assay זה משתמש תאי T או B נגזר עכבר מהונדס, שבו האמרגן Nur77 מניע ביטוי של GFP על טריקו או גירוי הקולטן B-cell. כשעוצמת GFP משקפת אתפעילות הפעלה / תעתיק של תא המטרה, assay שלנו מגדירה כלי רומן כדי לחקור את ההשפעה של תרכובת מסוימת (ים) על תגובות הסלולר / ביולוגיות. למשל, הקרנה עיקרית בוצעה באמצעות 4398 תרכובות בהעדר של "שערת יעד", אשר הובילה לזיהוי של 160 להיטים פוטנציאליים מוצגים פעילויות מערכת חיסוניות. לפיכך, השימוש של assay זה מתאים תוכניות לגילוי תרופות לחקור ספריות כימיות גדולות לפני לקדם במבחנה / in vivo מחקרי אימות.
Introduction
הקרנת תפוקה גבוהה (HTS) היא אסטרטגיה מוכחת לאימוץ נרחב לזיהוי מולקולות טיפוליות חדשות או עבור מחדש של תרופות ה- FDA באינדיקציות רפואיות חדשות. 1 עד כה, הצלחת HTS מושגת ניתן למדוד על ידי השפע של תרופות גילה בעבר. למשל, lapatinib מעכב טירוזין קינאז המשמש לטיפול בסרטן השד, סיטגליפטין; peptidase-4 dipeptidyl (DPP-4) inhibitor לשמש תרופה אנטי hyperglycemic, ואת dasatinib מעכב טירוזין קינאז Bcr-Abl אוראלי המשמש לטיפול לוקמיה מיאלואידית כרונית מייצגים כמה מהדוגמאות הלקוחות מתוך רשימה ארוכה של תרופות מאושרות גילה במקור על ידי HTS. 2 למרות התפוקה של תעשיית התרופות בזמן האחרון סבלה ממחסור בתגלית של ישויות כימיות חדשות, הסבירות של גילוי תרופות מוצלח ניתן לשפר באמצעות גידול במספר קנדידה טרום קלינייםtes מוצגת תכונות ביולוגיות / ביוכימיים modulatory. לפיכך, פיתוח מבחני HTS החדשים המותאמים להקרנת פנוטיפי יכול להציע את הפוטנציאל לספק כלים תרופתיים חשובים על גילוי להיטי תרופה חדשים. 3, 4, 5, 6 יתר על כן, HTS יכול להתבצע כעת בקצב מהיר בשל תמורות טכנולוגיות בולטות בשנים האחרונות כוללים התקנות רובוטית גמישות אישי מעוצב, טכנולוגיות לקריאה מתוך רומן מזעור נרחב. 2, 7 בין גורמי תורמי העניין הגובר שימוש הקרנת פנוטיפי (aka קדימה פרמקולוגיה) הוא התפייס כי התמקדות תופעות פונקציונליות ולא נחות הרדוקציונית פשטניות לגבי מטרות מולקולריות (/ הקרנת מבוססי יעד תגובות ביוכימיות) סבירה יותר כדי sho יעילות קלינית w. לפיכך, הקרנה פנוטיפי ולפוטנציאל לחשוף תרכובות חדשות טיפוליות פוטנציאל מסלולים מולקולריים של מחל כיום חשוכות. 2
כדי לזהות מעכבי או activators כראוי עבור מטרה מולקולרית נתון או פונקציה הסלולר, assay רגיש ואמין מאוד נדרש כדי להבדיל בין להיטים ישרי-לב תוצאות חיוביות שגויות. אז, מה עושה assay טוב? האיכות של assay נתון חייב להישפט לראשונה על ידי יחס אות לרעש (משתקף דרך גורם Z). 8 שנית, ההשפעה הממוקדת או המטרה של המסך צריכה לקבוע בנקל. לדוגמא, גישות מבוססות תאים פונקציונליים יכולות להציע יתרונות משמעותיים להקרנת קולטן להבדיל assay תוכננה במיוחד כדי להעריך קולטן ליגנד מחייב. הסיבה לכך היא כי הגישה השנייה לא יכולה להבדיל בין הליגנדים אגוניסט ו אנטגוניסט.ss = "Xref"> 9 לעומת זאת, גישה מבוססת תאים עשויה להיות יעילים יותר כפונקצית קולטן ניתן להעריך ישירות פנוטיפ ביולוגי (התפשטות, עיכוב מחזור התא, אפופטוזיס, ו / או בידול). עם זאת, יש לציין כי מבחני ביוכימיים יכולים לספק יתרונות משמעותיים על פני מבחני פנוטיפי כפי שהם מפרים על מטרה תאית ספציפית. Assay ביוכימיים היטב אופטימיזציה יהיה פחות פיזור נתונים בדרך כלל מאשר הקרנה פנוטיפי תוך פישוט לאחר מכן חקירות קשורות למנגנון המולקולרי תרופת פעולה. עם זאת, החסרון העיקרי של מבחני המטרה מבוסס או ביוכימי הסיכוי של הגברה בקצב להיטים חיוביים כוזבים שעשויים להשפיע מטרות הלא ספציפית כאשר נבדקו מערכת ביולוגית (פסד של סגוליות למדו במקור ב assay ביוכימיים). 10 למרות נקודה ומבוססת חתוכים בין להיטים שליליים וחיוביים יכולה לצמצם את מספר תוצאות חיוביות שגויות in ההקרנה הראשית, השימוש של מערכת רלוונטית מבחינה פיזיולוגית מחקה את הסביבה התאית היליד כגון תאים שלמים, כל רקמה או כל חיה נשארת הליבה של מטוטלת עיצוב assay. לכן, הקרנה פנוטיפי מאפשרת גילוי יתרון תופעות פנוטיפי ביולוגיות / רצויות מחלות ללא מטרות תרופה מזוהות ללא צורך בידע המוקדם של פעילות המתחמת או במצב של פעולה. 11
המחקר במסמך נוגע פיתוח ובדיקות של הקרנת פנוטיפי אופטימיזציה לשחזור המבוססת על שני מרכיבים חשובים: במודל של עכברים מסחריים קיים מש'-משנה מקובצים של תרכובות כימיות. עם כל הכבוד במודל חיה, assay מסתמך על השימוש של לימפוציטים שמקורו בזן העכבר (Nur77 GFP) מחסה כרומוזום בקטריאלי מלאכותי המכיל קלטת שבה הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הוא מונע על ידי האמרגן הדואר Nur77. 12 סימן ההיכר של גירוי זה מבוסס על העובדה כי Nur77 הוא גן מוקדם מיידי למעלה המוסדר הבא קולטן תאי T (TCR) או הקולטן B-cell (BCR) גירוי. 12 באשר שיטת ההקרנה עצם, גישה שמשה לעזור הימנעות הקרנת אנלוגים טריוויאלי תוך מזעור הזמן הנדרש כדי להעריך ספרייה כימית גדולה (> 10 5 תרכובות). לשם כך, מסד נתונים של תרכובות כימיות שנבחרו על ידי כימאים תרופתיים באמצעות כלי סריקה ממוחשבים נוצלו לזהות תרכובות דומות טופולוגית באמצעות מבני זרע פעילים המכונים אזכור. גישה זו אפשרה לנו מסך 4398 תרכובות מייצג ספרייה כוללת של מעל 136,000 ישויות כימיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
לקריאה מתוך מספר שיטות שנוצלו לפיתוח מבחני HTS רגישים ואמינים. אלה כוללים שיטות colorimetric, זורח או ניאון. למרות ששיטות colorimetric הן פשוט להגדיר, הם דורשים תוספות רבות של כימיקלים, אשר עלול להפריע או לשבש את התאים נבדקים. 23 בנוסף, הם אינם מאפשרים הערכה דינמית של תג…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות Merck Frosst Start-up שמספקת אוניברסיטת מונטריאול. ברצוננו להודות לד"ר ז'אן Duchaine ודומיניק Salois מהפלטפורמה תפוקה גבוהה במכון למחקר באימונולוגיה וסרטן לדיון, הערות פידבקים שלהם. Moutih Rafei בעל פרס 1 Fonds de la משוכלל ונדיר en Santé קוויבק ג'וניור.
Materials
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T- Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B- Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomed FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 hours incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
Referências
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
- Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
- Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O’Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
- Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
- Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
- Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
- An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
- Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
- Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
- Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735 (2013).
- Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
- Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
- Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
- Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
- Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
- Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
- Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).
