지역 필드 형광 현미경 : 본래 마음의 세포 신호 이미징
Summary
중심부에 위치한 분자 이벤트는 기관의 전기 및 수축 기능을 조정. 여기에 제시된 지역 필드 형광 현미경 기술의 집합은 그대로 마음에 휴대 변수의 기록을 할 수 있습니다. 심장 기능을 정의하는 메커니즘을 확인하면 마음이 병적 인 상황에서 어떻게 작동하는지 이해에 중요하다.
Abstract
심장에서 분자 신호 전달 연구는 일반적으로 고립 된 근육 세포에서 수행된다. 그러나, 허혈 및 부정맥과 같은 많은 병리학 적 상황은 완전히 전체 기관 수준에서 잘 이해 될 수있다. 여기서는 본래 심장 세포 신호를 측정 할 수 있도록 로컬 필드 형광 현미경 (LFFM) 분광 기법을 제시한다. 이 기술은 랑겐 돌프 관류 심장 및 형광 신호를 기록하는 광 화이버의 결합에 기초한다. LFFM 정상 및 병적 상태에서 마음을 연구하는 심장 혈관 생리학의 분야에서 다양한 응용 프로그램이 있습니다. 다중 심장 변수는 상이한 형광 표시기를 사용하여 모니터링 할 수있다. 다음은 세포질 [칼슘 2 +] 내 근질 세망 [칼슘 2 +]와 막 전위를 포함한다. 외인성 형광 프로브 흥분 방출 된 형광 LFFM의 표면 형광 기법의 세 가지 다른 배열 검출이 논문에서 제시 s의. 이러한 기술들 중 중앙의 차이는 여기하고 상기 여기 광을 변조 방식에 사용되는 광원의 종류이다. 연속파 LFFM (CLFFM)는 연속 여기 레이저 광을 사용하는 반면 펄스 LFFM (PLFFM)의 레이저 광 펄스를 사용한다. 마지막으로, 발광 다이오드 (LED)는 제 3 광원으로 사용했다. 이 비 간섭 장치는 펄스 형 LED 형광 현미경 (PLEDFM)라고한다.
Introduction
핵심은 심장 혈관 시스템의 중심 기관이다. 심장의 수축은 세포 내에서 증가 [칼슘 2 +]에 의해 시작된다. 세포 내 칼슘 방출의 전기적 흥분성 변화 사이의 관계는 역사적으로 효소 적 세포 해리 (1, 2)에서 연구되고있다. 그러나, 심근 세포 대사되어 전기적 및 기계적 4 3 결합된다. 격리되면, 근육 세포가 물리적으로 결합되지 없지만, 상이한 계층에서 심근 세포를 해리 5 동안 혼합한다. 또한, 전압 클램프 조건 하에서 분리 된 세포 연구로부터 나왔다 막대한 장점, 6, 7, 8의 전기 syncytium ALWA 같은 심장의 본질 불구YS는 조직 3에 존재하는 것과 세포를 분해하는 방법을 기능적으로 다른 질문을 제기.
이 논문에서는 본래 심장 로컬 필드 형광 현미경 (LFFM) 기술을 사용하여 심장 생리학의 기술에서 얻어진 발전을 설명한다. LFFM는 세포질 칼슘, 내 근질 세망 (SR) 칼슘과 막 잠재력 등 여러 생리적 변수를 측정하는 형광 표시를 사용합니다. 이러한 측정은 심실 압력 9, 10, 9 심전도, 전기 활동 전위 (APS), 이온 전류 및 기록 갇힌 화합물 (4)의 플래시 광분해, (11)과 함께 동시에 얻을 수있다. 또한, 이들 측정은 가까운 높은 주파수에서 그대로 심장 페이싱에 의해 얻을 수있다생리 요금에 연구. 여러 문서 있지만 9, 11, 12, 13, 14 LFFM 기술을 이용하여 우리 그룹에 의해 출판 된, 이러한 기술과 관련된 기술적 인 복잡성의 추정은 심장 및 다른 기관에 생체 생리 현상 공부의 다량 사용을 방지하고있다.
LFFM 기술 (도 1)이 조직과 접촉하는 멀티 모드 광파이버를 사용하여 얻어진 표면 형광 측정에 기초한다. 접촉 형광 영상 법처럼, 광학 해상도는 직경, 섬유의 개구 수 (NA)에 따라 달라진다. 광섬유의 NA보다 작은 직경 측정의 공간 해상도를 증가시킬 것이다. NAS 및 섬유 직경은 각각 0.22에서 mm 0.66과 μm의 1 (50)에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 에서개구를 주름은 큰 입체각에서 도착 광자를 받아들임으로써 잡음비 (S / N)에 신호를 개선한다. 표면 형광 장치로서 작용하기 위해서는, 광 빔은 비구면 렌즈 표면 형광 또는 목적을 가진 광섬유에 집중되는 경우, 렌즈의 NA와 광 매치. 이 검색은 여기 및 형광 물질에 의해 방출되는 광자를 다시 수집하는 에너지 전달을 최대화한다.
조직에 들어 외인성 형광 표시기를 자극하기 위해, 다른 광원, 조명 모드가 이용 될 수있다. 펄스 지역 필드 형광 현미경 (3), 12 (PLFFM)를 사용하여 우리의 선구적인 연구는 저가의 피코 초 레이저 (그림 1a, PLFFM)를 사용. 광원이 유형의 실질적으로 인한 색소 표백 않고 조명 영역 하에서 형광 분자의 흥미로운 큰 분획의 큰 장점을 갖는다짧은 펄스 (12) 기간. 게다가 초단 펄스의 사용은 염료 (12)의 형광 수명의 평가를 허용했다. 형광 수명은 칼슘 결합 염료 분자의 비율을 정량하는 데 사용될 수있는 특성이다. 불행히도, 펄스 간에서 진폭 펄스 및 변화의 시간적 터링 색소에 결합하는 리간드에 의해 생성 된 형광의 변화가 큰 경우에,이 실험 전략의 적용을 제한한다.
연속파 (CW) 레이저는 일반적 LFFM (도 1b, CLFFM)의 메인 조명 원으로 사용된다. 레이저 빔은 연속 조직을 조명하거나 ferroelectrically 변조 될 수있다. 빔의 강유전체 변조 마이크로 광 펄스를 생성 할 수있다. 이 변조는 외부의 하드웨어에 의해 제어 될 수있다. 이 절차는뿐만 아니라 극적으로 t을 감소그는 광 펄스의 시간적 지터하지만, 또한 서로 다른 파장의 광선을 혼합 할 수 있습니다. 보의 혼합은 다른 레이저에서 다중 광선에 의해 수행된다. 결과적으로, 상이한 스펙트럼 특성을 가지는 다수의 염료는, 예를 들면, 생리 학적 변수의 다양한 측정을 수행하도록 기대 될 수 루비로드 -2- 세포질 칼슘 들면 MagFluo4 인트라 SR 칼슘 및 디 -8- ANEPPS 대한 대 막 잠재력.
LFFM의 광원으로서 레이저가 본 다양한 장점 있지만, 광원의 다른 유형의 발광 다이오드 (LED)를 포함하여 사용할 수있다. 이 경우, 상기 여기 광원은 InGaN으로 LED (도 1C, PLEDFM)로 구성되었다. 전도대의 전자가 가전 자대의 정공과 재결합 할 때의 LED에서 광자 자발적 방출된다. 고체 레이저와의 차이는 발광 다른 광자에 의해 자극되지 않는다는 것이다. 이것은 비 – 간섭 성 빔의 결과LED의 넓은 스펙트럼 방사.
하이 파워 LED의 종류가 사용될 수있다. 디 -8- ANEPPS 및 CA에 대해를 사용하여 AP의 레코딩을위한 2+ 과도 FLUO-4 또는 크기 – FLUO-4, 우리는 485 나노 미터 (블루), 20 nm의 절반 폭의 전형적인 피크 방출을 갖는 LED를 사용하여 기록 (그림 1D). 루비로드-2로 기록 칼슘 과도를 들어, LED는 540 nm의 (녹색), 35 nm의 (도 1D)의 절반 폭 일반적인 발광 피크를 가지고 있었다. LED는 밴드 파장에서 방출하기 때문에 자신의 스펙트럼 방사를 좁힐 필터를 필요로한다. 또, 펄스 광은 20 μs의 지속 시간 1.6 kHz의 속도로 생성 될 수있다. LED는 빠르고 전력 MOSFET 전계 효과 트랜지스터로 펄스 하였다. 다른 지표 동시 녹화 시간 다중화 LED에 의해 수행 될 수있다. 불행히도, LED에 의해 방출 된 광은 레이저 광과 비교하여 광섬유에 초점을 더 어렵다. 따라서, 우리의 주요 단점LED를 보내고 그들의 방출 프로파일 메인 축으로부터의 각도 변위 (± 15 °)를 가지며, 보조 광학 그것을 보정하기 위해 사용되어야한다는 것이다.
전술 한 광학 모든 구성에서, 여기 광은 다이크로 익 미러의 도움으로 반사된다. 빔이어서 조직에 위치하는 다중 모드 광섬유 상에 비구면 렌즈는 현미경 대물 렌즈에 의해 집광된다. 모든 표면 형광 장치에서와 같이, 다이크로 익 미러는 출사 된 광으로부터 음원을 분리하는 역할을한다. 방출 된 빛의 스펙트럼은 반영 여기를 제거하기 위해 다시 차단 필터를 통해 이동한다. 마지막으로, 출사 광은 광 검출기 (도 1) 상에 목적으로 집중된다.
전류 빛의 전달은 실리콘 애벌 런치 포토 다이오드에 의해 수행된다. 이 다이오드는 빠른 응답 및 낮은 광 검출을 허용하는 높은 감도를 가지고있다. 그만큼애벌랜치 포토 다이오드에 의해 생성 된 광전류는 두 가지 방식으로 증폭 될 수있다 : 트랜스 임피던스 증폭기의 전압 (도 1F)로 전류 변환하는 저항성 피드백 요소 (도 1E)을 갖는 또는 적분기로. 첫 번째 방법을 사용하여, 출력 전압과 광전류 피드백 저항에 비례한다. 피코 초 레이저 펄스의 저항 검출의 전형적인 예는도 2a, 2b 및 2c에 도시되어있다. 패널 2a는 트랜스 임피던스 증폭기의 출력을 도시하고 패널 (2B)은 별표 (*)로 표시된 구간의 시간 전개를 보여준다. 피크 추적 알고리즘은 형광 응답 (12)의 피크 (적색)과베이스 (녹색)을 검출하도록 실시 하였다. 기본 형광 측정은 주변 조명기구에 의해 도입 된 애벌랜치 포토 다이오드의 암전류와 간섭 양자의 정보를 제공한다HT 및 전자기 커플 링. 피크 염기의 표현은도 2c에 도시된다. 이 그림은 박동 잉꼬 심장의 심장주기 동안 2 + 칼슘 결합 염료 (루비로드-2)에 의해 방출되는 형광을 보여줍니다.
두 번째 방법에있어서, 상기 적분기의 출력 전압 및 전류 피드백 용량의 함수이다 (도 2D, 2E 및 2F). 어떤 외부 조명과 제 1 및 펄스 LED로부터인가 된 광 펄스와 두 번째 그림 2 층은 두 개의 연속적인 통합주기를 보여줍니다. 자세한 설명은도 2g과 2 시간에 제시되어있다. 이 접근법은 더 힘든 있지만 의한 피드백 커패시터의 열 잡음의 부재로 큰 S / N을 제공한다. 기기는 여기 광을 모두 제어 다중화를 생성하고 headstage 통합 및 입술 명령하는 타이밍 단을 포함등 기간. 이것은 일반적으로도 데이터의 온라인 회귀 계산으로 통합 된 출력 신호의 디지털 미분을 행하는 디지털 신호 처리 회로가 수행된다. 저항 피드백을 사용하는 경우에는, 어느 A / D 수집 보드를 사용할 수있다.
마지막으로, 우리 LFFM 기법 다용도이며 하나 이상의 영역으로부터 기록하도록 구성 될 수있다. 빛의 경로에 빔 스플리터를 추가하면 우리는 두 개의 광섬유로 빛을 분할 할 수 있습니다. 각 광섬유는 그 외인성 형광 프로브로부터 독립적으로 여기시키기 조직 기록 방출 서로 다른 영역에 배치 될 수있다. 이 수정은 생리 학적 변수에 영향을 미치는 방법을 해부학 적 지역적 차이 평가하기 위해 우리를 허용합니다. 도 3은 두 개의 광 화이버는 전층 전기 또는 세포를 측정하기 위해 사용되는 CW 여기 광을 분할하기 위해 사용되는 빔 스플리터를 도시한다 [칼슘] 레벨 재치시간 마이너 침입. 전층 신호는 하나의 내막의 섬유 심실 벽의 외막 층의 다른 배치하여 기록 할 수있다. 따라서, LFFM 기술은 상이한 영역에서 셀룰러 신호의 시간 경과를 측정하는 기능이 지역 변경 병리학 적 상황에서 발생하는지 테스트하는데 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서는 심장 근세포 생체의 기능을 평가하기 위해 국소 체 형광 기술을 설명하기에 중심. 결합 된 환경에서 이러한 세포의 연구뿐만 아니라 더 많은 생리적 인뿐만 아니라 장기 레벨 병리학을 평가하기위한 매우 적합하다. 여기 수축 커플 링 (ECC)를 기본 셀룰러 이벤트 세포 내 칼슘 역학을 모니터링 분자 프로브의 사용과 전체 기관 수준에서 (루비로드 2 세포질 칼슘을 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 제시된 작품의 중요한 논의 박사 알리샤 Mattiazzi 감사합니다. 이 작품은 NIH로부터 연구비 (R01 HL-084487) ALE에 지원되었다.
Materials
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2um nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20×13 | |
| 60mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6"x6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4'x6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25mmx75mmx10mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C | |
Referências
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