Champ local Fluorescence Microscopy: Imagerie signaux cellulaires dans les coeurs intacts
Summary
Dans le cœur, les événements moléculaires coordonnent la fonction électrique et contractile de l'organe. Un ensemble de techniques de microscopie de fluorescence de champ locales présentées ici permet l'enregistrement des variables cellulaires dans les cœurs intacts. mécanismes définissant la fonction cardiaque Identifier est essentiel dans la compréhension comment le cœur fonctionne dans des situations pathologiques.
Abstract
Dans le cœur, les études de signalisation moléculaire sont généralement effectuées dans des myocytes isolés. Cependant, de nombreuses situations pathologiques telles que l'ischémie et de l'arythmie ne peuvent être pleinement compris au niveau de l'organe entier. Ici, nous présentons la technique spectroscopique de microscopie par fluorescence de champ local (LFFM) qui permet la mesure de signaux cellulaires dans le coeur intact. La technique est basée sur une combinaison d'un coeur perfusé de Langendorff et des fibres optiques pour enregistrer les signaux fluorescents. LFFM a diverses applications dans le domaine de la physiologie cardiovasculaire pour étudier le cœur dans des conditions normales et pathologiques. les variables cardiaques multiples peuvent être surveillés à l'aide de différents indicateurs fluorescents. Ceux – ci comprennent cytosolique [Ca 2+], le réticulum sarcoplasmique intra-[Ca2 +] et du potentiel de membrane. Les sondes fluorescentes exogènes sont excités et la fluorescence émise détectés avec trois arrangements différents de la technique LFFM épifluorescences présenté dans cet article. Les différences entre ces centrales techniques sont le type de source de lumière utilisée pour l'excitation et sur la façon dont la lumière d'excitation est modulée. Le LFFM pulsée (PLFFM) utilise des impulsions de lumière laser en onde continue LFFM (CLFFM) utilise la lumière laser continu pour l'excitation. Enfin, on a utilisé comme troisième source de lumière des diodes électroluminescentes (DEL). Cet arrangement non cohérent est appelé pulsée microscopie à fluorescence LED (PLEDFM).
Introduction
Le cœur est l'organe central du système cardio-vasculaire. La contraction du coeur est déclenchée par une augmentation intracellulaire [Ca2 +]. La relation entre l' excitabilité électrique et les changements dans le Ca2 + intracellulaire de presse a été historiquement étudié dans les cellules dissociées enzymatiquement 1, 2. Cependant, les cellules cardiaques sont électriquement, métaboliquement et mécaniquement couplés 3, 4. Lorsqu'elle est isolée, les myocytes sont non seulement physiquement découplés, mais myocytes de différentes couches sont mélangés lors de la dissociation 5. En outre, malgré les énormes avantages qui ont émergé de l'étude des cellules isolées dans des conditions de serrage de tension, 6, 7, 8 la nature intrinsèque du cœur comme un syncytium alwa électriqueys pose la question de savoir comment fonctionnellement différentes sont dissociées de celles des cellules présentes dans le tissu 3.
Dans ce manuscrit, nous décrivons les progrès obtenus dans la connaissance de la physiologie cardiaque par l'utilisation de la microscopie à fluorescence de champ local (LFFM) techniques dans le coeur intact. LFFM utilise des indicateurs fluorescents pour mesurer plusieurs variables physiologiques tels que cytosolique Ca 2+, intra réticulum sarcoplasmique (SR) Ca 2+ et le potentiel de membrane. Ces mesures peuvent être obtenues simultanément et conjointement avec la pression ventriculaire 9, 10, électrocardiogrammes 9, potentiels d'action électriques (AP), les enregistrements actuels ioniques et flash photolyse de composés en cage 4, 11. En outre, ces mesures peuvent être obtenues par la stimulation du coeur intact à des fréquences plus élevées à proximitér aux taux physiologiques. Bien que plusieurs articles 9, 11, 12, 13, 14 ont été publiés par notre groupe en utilisant des techniques de LFFM, la présomption de complexités techniques liées à cette technique a empêché son utilisation massive dans l' étude ex vivo des phénomènes physiologiques dans le cœur et d' autres organes.
La technique de LFFM (figure 1) est basée sur des mesures de épifluorescence obtenues à l' aide d' une fibre optique multimode en contact avec le tissu. Comme toute technique d'imagerie par fluorescence de contact, la résolution optique est fonction du diamètre et de l'ouverture numérique (NA) de la fibre. Un diamètre supérieur et inférieur NA de la fibre augmente la résolution spatiale des mesures. AN et des diamètres de fibres peuvent varier 0,22 à 0,66 et de 50 um à 1 mm. Dansplisser le NA permettra d'améliorer le rapport signal sur bruit (S / N) en acceptant des photons arrivant d'un angle solide plus grande. Afin d'agir en tant que dispositif de épifluorescence, le faisceau lumineux est focalisé dans la fibre optique avec une lentille asphérique ou un objectif de épifluorescence où le NA de la lentille et le match de la fibre. Cette mise en correspondance de maximiser le transfert d'énergie d'excitation et de collecte de retour des photons émis par le fluorophore.
Pour exciter les indicateurs fluorescents exogènes chargés dans le tissu, les différentes sources lumineuses et de modes d'éclairage peuvent être utilisés. Nos études pionnières en utilisant le champ pulsé locale de microscopie par fluorescence 3, 12 (PLFFM) ont utilisé un laser à faible coût picoseconde (figure 1a, PLFFM). Ce type de source de lumière a l'énorme avantage d'exciter une grande fraction des molécules fluorophores sous la zone d'éclairage sans blanchiment sensiblement le colorant dueà l'impulsion courte durées 12. En outre, l'utilisation d'impulsions ultracourtes a permis l'évaluation de la durée de vie de fluorescence du colorant 12. La durée de vie de fluorescence est une propriété qui peut être utilisée pour quantifier la fraction des molécules de colorant liées au Ca 2+. Malheureusement, le sautillement temporelle des impulsions et des variations d'amplitude de l'impulsion à impulsion limiter l'application de cette stratégie expérimentale pour les cas où le changement de fluorescence produite par la liaison au colorant ligand est grande.
Vague (CW) lasers continus sont généralement utilisés comme la principale source d'éclairage dans LFFM (figure 1b, CLFFM). Le faisceau laser peut illuminer le tissu en continu ou peut être modulé ferroélectrique. La modulation du faisceau ferroélectrique permet la génération d'impulsions d'une microseconde de lumière. Cette modulation peut être commandée par le matériel externe. Cette procédure réduit non seulement considérablement til jittering temporel des impulsions lumineuses, mais permet également le mélange des faisceaux de longueurs d'onde différentes. Le mélange des faisceaux est réalisée par multiplexage de différents rayons lasers. En conséquence, plusieurs colorants ayant des propriétés spectrales différentes peuvent être excités pour effectuer des mesures d'une variété de variables physiologiques, par exemple, Rhod-2 Ca2 + cytosolique, MagFluo4 intra-SR Ca 2+ et di-8-ANEPPS pour le potentiel membranaire.
Bien que les lasers présentent divers avantages que la source lumineuse dans LFFM, d'autres types de sources lumineuses peuvent être utilisées, y compris des diodes électroluminescentes (DEL). Dans ce cas, la source de lumière d'excitation est composée d'une LED InGaN (Figure 1c, PLEDFM). Dans les LED, les photons sont émis spontanément lorsque les électrons de la bande de conduction recombinent avec des trous dans la bande de valence. La différence avec les lasers à l'état solide est que l'émission ne soit pas stimulée par d'autres photons. Il en résulte un faisceau non cohérent etune émission spectrale plus large pour les LED.
Différents types de LED haute puissance peuvent être utilisés. Pour les enregistrements AP en utilisant Di-8-ANEPPS et pour Ca2 + transitoires enregistrés en utilisant Fluo-4 , ou en alliage d'aluminium -Fluo-4, on utilise une diode électroluminescente qui présente une émission de crête typique à 485 nm (bleu) et une demi – largeur de 20 nm (Figure 1d). Pour Ca 2 + transitoires enregistrées avec Rhod-2, la LED a eu un pic d' émission typique à 540 nm (vert) et une demi – largeur de 35 nm (figure 1d). LED émettent dans une longueur d'onde de la bande et nécessitent donc des filtres pour affiner leur émission spectrale. En outre, la lumière puisée peut être généré à un débit de 1,6 kHz avec une durée de 20 ps. Les LEDS ont été puisées avec un transistor à effet de champ MOSFET de puissance rapide. des enregistrements simultanés avec différents indicateurs peuvent être effectués par multiplexage temporel des diodes électroluminescentes. Malheureusement, la lumière émise par les LED est plus difficile de se concentrer sur une fibre optique par rapport à un faisceau laser. Ainsi, le principal inconvénient de nousing LED est que leurs profils d'émission ont des déplacements angulaires (± 15 °) de l'axe principal, et un élément optique auxiliaire doit être utilisé pour la corriger.
Dans toutes les configurations optiques décrit précédemment, la lumière d'excitation est réfléchie à l'aide d'un miroir dichroïque. Le faisceau est ensuite focalisé par une lentille asphérique et un objectif de microscope sur une fibre optique multimode qui est positionné sur le tissu. Comme dans tout dispositif d'épifluorescence, le miroir dichroïque sert également à séparer l'excitation de la lumière émise. Le spectre de la lumière émise se déplace à travers un filtre de barrière pour éliminer toute excitation réfléchie. Enfin, la lumière émise est focalisée avec un objectif sur un photodétecteur (Figure 1).
La transduction de la lumière au courant électrique est effectuée par des photodiodes à avalanche de silicium. Ces diodes ont une réponse rapide et une sensibilité élevée permettant la détection de faible luminosité. lephotocourant produit par les photodiodes à avalanche peut être amplifié de deux manières: un amplificateur à transimpédance comportant un élément de contre- réaction résistif (figure 1E) , soit par un intégrateur pour convertir le courant en une tension (figure 1f). En utilisant la première approche, la tension de sortie est proportionnelle au courant photoélectrique et de la résistance de rétroaction. Un exemple typique de la détection de résistance de picosecondes impulsions laser est représenté sur les figures 2a, 2b et 2c. Panneau 2a illustre la sortie de l'amplificateur à transimpédance et le panneau 2b montre une expansion temporelle de l'intervalle indiqué par un astérisque (*). Un algorithme de suivi de pic a été mis en oeuvre pour détecter le pic (rouge) et la base (vert) pour les réponses fluorescentes 12. La mesure de la fluorescence de base fournit des informations à la fois du courant d'obscurité de la photodiode à avalanche et les interférences introduites par lig ambianteht et le couplage électromagnétique. Une représentation de sommets et bases est représentée sur la figure 2c. Cette figure illustre la fluorescence émise par le colorant (Rhod-2) lié à Ca 2+ au cours du cycle cardiaque d'un cœur battant perruche.
Dans le second procédé, la tension de sortie de l'intégrateur est une fonction de la rétroaction de courant et capacitif (figures 2d, 2e et 2f). La figure 2f montre deux cycles d'intégration consécutives: la première sans l' éclairage extérieur et la seconde avec des impulsions de lumière appliquées à partir d' une diode pulsée. Une description détaillée est présentée dans les figures 2g et 2h. Cette approche, bien que plus laborieuse, fournit un rapport S / N plus grand en raison de l'absence de bruit thermique dans le condensateur de rétroaction. L'instrument comprend une étape de synchronisation qui génère tout le contrôle et le multiplexage de la lumière d'excitation et commande l'intégration et headstage respériodes et. Ceci est habituellement réalisé avec un circuit numérique de traitement du signal qui effectue également une différenciation numérique du signal intégré de sortie en calculant une régression en ligne des données. Dans le cas d'utilisation d'une rétroaction résistive, toute A / D acquisition carte peut être utilisée.
Enfin, notre technique de LFFM est très polyvalent et peut être adapté à enregistrer à partir de plus d'une région. Ajout d'un diviseur de faisceau dans le trajet de la lumière nous permet de diviser la lumière en deux fibres optiques. Chaque fibre optique peut ensuite être placé sur différentes régions d'un tissu à, indépendamment, exciter et enregistrer les émissions des sondes fluorescentes exogènes. Cette modification nous permet d'évaluer dans quelle mesure les différences anatomiques régionales influencent les variables physiologiques. La figure 3 montre un diviseur de faisceau étant utilisé pour diviser la lumière d' excitation CW de telle sorte que deux fibres optiques sont utilisés pour mesurer transmural intracellulaire électrique ou [Ca 2+] niveaux d' esprith mineur-invasivité. transmurale signaux peuvent être enregistrés en plaçant une fibre sur l'endocarde et l'autre sur la couche d'épicarde de la paroi ventriculaire. Par conséquent, la technique de LFFM a la capacité de mesurer l'évolution temporelle des signaux cellulaires dans des régions différentes et peut être utilisée pour tester si des changements se produisent dans la région des situations pathologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce document est centré dans la description des techniques de fluorescence de terrain locales pour évaluer la fonction des myocytes cardiaques ex vivo. L'étude de ces cellules dans un milieu couplé est non seulement plus physiologique, mais il est également très appropriée pour évaluer les pathologies au niveau de l'organe. Les événements cellulaires sous – jacents couplage excitation-contraction (ECC) peuvent être évalués au niveau de l' organe entier avec l'utilisation de sondes mo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Alicia Mattiazzi pour la discussion critique des travaux présentés. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (R01 HL-084487) à ALE.
Materials
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2um nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20×13 | |
| 60mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6"x6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4'x6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25mmx75mmx10mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C | |
Referências
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