Akuta och kroniska modeller av hyperglykemi i sebrafisk: En metod för att bedöma effekterna av hyperglykemi på neurogenes och biodistribution av radiomärkta molekyler

Summary

I detta arbete beskrivs metoder för att fastställa akuta och kroniska hyperglykemodeller i zebrafisk. Syftet är att undersöka effekten av hyperglykemi på fysiologiska processer, såsom konstitutiv och skadainducerad neurogenes. Arbetet belyser också användningen av zebrafisk för att följa radiomärkta molekyler (här, [ ¹⁸ F] -FDG) med användning av PET / CT.

Abstract

Hyperglykemi är en stor hälsofråga som leder till hjärt- och cerebral dysfunktion. Det är till exempel förknippat med ökade neurologiska problem efter stroke och är visat att det påverkar neurogena processer. Intressant har den vuxna zebrafisken nyligen framkommit som en relevant och användbar modell för att efterlikna hyperglykemi / diabetes och att undersöka konstitutiv och regenerativ neurogenes. Detta arbete ger metoder för att utveckla zebrafiskmodeller av hyperglykemi för att undersöka effekten av hyperglykemi på hjärncellsproliferation under hemostatiska och hjärnans reparationsförhållanden. Akut hyperglykemi är etablerad med intraperitoneal injektion av D-glukos (2,5 g / kg kroppsvikt) i vuxen zebrafisk. Kronisk hyperglykemi induceras genom nedsänkning av vuxen zebrafisk i D-glukos (111 mM) innehållande vatten i 14 dagar. Blod-glukosnivåmätningar beskrivs för dessa olika tillvägagångssätt. Metoder för att undersöka effekten av hyperglykemi på konstitutiv aNd regenerativ neurogenes, genom att beskriva telensfalonens mekaniska skada, dissekera hjärnan, paraffininbäddning och sektion med en mikrotom och utföra immunohistokemiprocedurer, visas. Slutligen beskrivs även metoden att använda sebrafisk som en relevant modell för studier av biodistribution av radiomärkta molekyler (här, [18F] -FDG) med användning av PET / CT.

Introduction

Hyperglykemi definieras som överdrivna blodglukosnivåer. Även om det kan återspegla akut stress, är hyperglykemi också ett tillstånd som ofta leder till diagnos av diabetes, en kronisk störning av insulinutsöndring och / eller resistens. År 2016 har antalet vuxna som lever med diabetes nått 422 miljoner världen över, och varje år dör 1,5 miljoner människor från denna sjukdom, vilket gör det till ett stort hälsoproblem ¹ . Faktum är att okontrollerad diabetes leder till flera fysiologiska störningar som påverkar hjärt-kärlsystemet, njurarna och perifera och centrala nervsystemet.

Intressant kan akut och kronisk hyperglykemi förändra kognition och bidra till både demens och depression ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Dessutom är patienternas tillträde wIth hyperglykemi har associerats med sämre funktionella, neurologiska och överlevnadsresultat efter ischemisk stroke ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11} . Det visades också att hyperglykemi / diabetes påverkar vuxen neurogenes, en process som leder till generering av nya neuroner, genom att påverka neuralt stamcellsaktivitet och neuronal differentiering, migration och överlevnad ^{2 , 12} .

I motsats till däggdjur visar teleostfisk, som sebrafisk, intensiv neurogen aktivitet i hela hjärnan och uppvisar en enastående kapacitet för hjärnreparation under vuxen ålder ^{13 , 14 , 15 , 16} . I synnerhet är sådana kapaciteter möjliga på grund av neu-kvarhållandetRal stam / progenitor celler, inklusive radiell glia och neuroblaster ^{17 , 18 , 19} . Dessutom har zebrafisken nyligen kommit fram som en modell för att studera metaboliska störningar, inklusive fetma och hyperglykemi / diabetes ^{20 , 21 , 22} .

Trots att zebrafisken är en välkänd modell för hyperglykemi och neurogenes har få studier undersökt effekten av hyperglykemi på hjärnhomostas och kognitiv funktion ^{12 , 23} . För att bestämma effekterna av hyperglykemi på konstitutiv och skadainducerad hjärncellsproliferation skapades en modell av akut hyperglykemi genom intraperitoneal injektion av D-glukos. Dessutom reproducerades en modell av kronisk hyperglykemi genom nedsänkning av fisk i vatten kompletterad wMed D-glukos ¹² . Zebrafish uppvisar många fördelar i forskning. De är billiga, lätta att höja och genomskinliga under de första utvecklingsstadierna, och deras genom har sekvenserats. I samband med detta arbete uppvisar de också flera ytterligare fördelar: (1) de delar liknande fysiologiska processer med människor, vilket gör dem till ett kritiskt verktyg för biomedicinsk forskning; (2) de tillåter snabb undersökning av effekterna av hyperglykemi på hjärnhomostas och neurogenes, med tanke på deras utbredd och starka neurogena aktivitet; Och (3) de är en alternativ modell som möjliggör minskning av antalet däggdjur som används i forskning. Slutligen kan zebrafisk användas som en modell för testning av biodistribution av radiomärkta molekyler och potentiella terapeutiska medel med användning av PET / CT.

Det övergripande målet med följande procedur är att visuellt dokumentera hur man ställer upp modeller av akut och kronisk hyperglykemi i zebrafisk, använd zebRafish för att bedöma hjärnomvandling i hyperglykemiska förhållanden och övervaka radiomärkta molekyler (här, [18F] -FDG) med användning av PET / CT.

Protocol

Vuxen vildtype zebrafisk ( Danio rerio ) bibehölls under standardfotoperiod (14/10 h ljus / mörk) och temperatur (28 ° C). Alla försök utfördes i enlighet med riktlinjerna för franska och europeiska gemenskaperna för användning av djur i forskning (86/609 / EEG och 2010/63 / EU) och godkändes av den lokala etiska kommittén för djurförsök. 1. Upprättande av en modell av akut hyperglykemi hos sebrafisk Förbered en stamlösning av tricin (MS-222) genom att l?…

Representative Results

Genom att använda de procedurer som beskrivs i denna artikel utfördes intraperitoneal injektion av D-glukos (2,5 g / kg kroppsvikt) hos vuxna zebrafisk och ledde till en signifikant ökning av blodglukosnivåerna 1,5 h efter injektion ( Figur 1A ). 24 h efter injektion liknade blodglukosnivåerna mellan D-glukos och PBS-injicerad fisk 12 . För kronisk behandling nedsänktes sebrafisk i D-glukosvatten (111 mM) och blev hyperglykemis…

Discussion

I detta arbete beskrivs olika metoder för att fastställa akuta och kroniska modeller av hyperglykemi hos zebrafisk. De viktigaste fördelarna med dessa förfaranden är att: (1) de möjliggör en minskning av antalet däggdjur som används för forskning, (2) de är enkla att inrätta och snabbt genomföra, och (3) de är ekonomiska. Därför möjliggör sådana modeller för undersökning av effekterna av hyperglykemi på ett stort antal djur för att studera dess inverkan på olika fysiologiska processer, inklusive …

Materials

1mL Luer-Lok Syringe	BD, USA	309628
4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich, Germany	D8417
7 mL bijou container plain lab	Dutscher, France	080171
D-glucose	Sigma-Aldrich, Germany	67021
Digital camera	Life Sciences, Japan	Hamamatsu ORCA-ER
Disposable base molds	Simport, Canada	M475-2
Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488	Life Technologies, USA	A21206
Embedding center	Thermo Scientific, USA	Shandon Histocentre 3
Fluorescence microscope	Nikon, Japan	Eclipse 80i
Fluorodeoxyglucose (18F-FDG)	Cyclotron, France
Glucometer test strip	LifeScan, France	One-Touch 143 Ultra
Goat anti-mouse Alexa fluor 594	Life Technologies, USA	A11005
In-Vivo Imaging System	TriFoil Imaging, Canada	Triumph Trimodality
Microtome	Thermo Scientific, USA	Microm HM 355 S
Monoclonal mouse anti-PCNA	DAKO, USA	clone PC10
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Germany	P6148-500G
Polyclonal rabbit anti-GFAP	DAKO, USA	Z033429
Slide drying bench	Electrothermal, USA	MH6616
Sodium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
Sodium citrate trisodium salt dehydrate	Prolabo, France	27833.294
Sterile needle	BD Microlance 3	30 G 1/2 ; 0.3 mm x 13 mm
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Student surgical scissors	Fine Science Tools	91400-14
Superfros Plus Gold Slides	Thermo Scientific, USA	FT4981GLPLUS
Surgical microscope	Leica, France	M320-F12
Tissue embedding cassettes	Simport, Canada	M490-10
Tissue embedding medium	LeicaBiosystems, USA	39602004
Toluene	Sigma-Aldrich, Germany	244511
Tricaine MS-222	Sigma-Aldrich, Germany	A5040
Triton X100	Sigma-Aldrich, Germany	X100-500 mL
Vectashield medium	Vector Laboratories, USA	H-1000
Xylene	Sigma-Aldrich, Germany	534056
Fish Strain	AB
Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter)			For preparing 10X PBS, add the following  salts and complete to 1 liter with distilled water
Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g	Sigma-Aldrich, Germany	746436
Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g	Sigma-Aldrich, Germany	795488
Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g	Sigma-Aldrich, Germany	795410