Pinnurvalsmetoden för påvisande av humana Norovirus på ytor

Summary

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Abstract

Mänskliga norovirus är en ledande orsak till epidemin och sporadisk gastroenterit hela världen. Eftersom de flesta infektioner är antingen sprids direkt via den person-till-person rutt eller indirekt genom miljö ytor eller mat, förorenade fomiter och livlösa ytor är viktiga fordon för spridning av viruset under norovirusutbrott.

Vi utvecklade och utvärderade ett protokoll med hjälp av makroskum svabbar för detektering och typning av humana norovirus från hårda ytor. Jämfört med fiber spets kompresser eller antistatiska våtservetter, makroskum kompresser tillåter virusutvinning (intervall 1,2-33,6%) från toalettsitsen ytor på upp till 700 cm ^2. Protokollet inkluderar stegen för utvinning av viruset från bomullstopparna och ytterligare koncentration av det virala RNA med användning av centrifugeringskolonner. Totalt 127 (58,5%) av 217 pinnprover som samlats in från ytor i kryssningsfartyg och långvårdsanläggningar där norovirus gastroenterit hade varitrapporterade testat positivt för GII norovirus genom RT-qPCR. Av dessa 29 (22,8%) kunde framgångsrikt genotypas. Sammanfattningsvis, detektion av norovirus om miljö ytor använder protokollet vi utvecklat kan bidra till fastställandet av miljöföroreningar under utbrott samt detektion av virus när kliniska prover inte är tillgängliga; Det kan också underlätta övervakningen av effektiviteten i saneringsstrategier.

Introduction

Mänskliga norovirus är en ledande orsak till epidemin och sporadisk akut gastroenterit i världen ^{en, två, tre.} Viruset är mycket smittsam och överföring sker genom direkt person till person interaktion eller indirekt genom kontakt med förorenat mat, vatten eller miljö ytor. Norovirus kan kasta under längre perioder och förlängd överlevnad av viruset på miljö ytor har dokumenterats ^{en, två, tre.} Under topp avlösning, är miljarder av viruspartiklar frigörs per gram avföring och uppkastningar innehåller även ett tillräckligt antal virala partiklar att orsaka infektion ^{4, 5, 6, 7, 8,}EF "> ^{9, 10.} Dessutom kan överföring av viruset mellan livlösa ytor och mänsklig hud uppstår lätt ^{2, 11, 12.} Därför kan övervakningen av miljöförorening bistå vid undersökningar av sjukdomsutbrott och bedöma effektiviteten av saneringen och desinfektion.

Flera provtagningsprotokoll miljö har beskrivits för detektion av rotavirus, colifag MS2, felint calicivirus (FCV), och bakteriofag P22 ^{13, 14, 15, 16.} Men validerings villkor som beskrivs i dessa studier, inklusive snabb uttorkning (<1 timme) och små ytor (25 x 100 cm ^2), får inte tillräckligt representera inställningar. Dessutom förväntas kontamineringen av environmental ytor kräver protokoll som är i stånd att detektera mycket få viruspartiklar.

Vi utvecklade ett makroskum baserad yta provtagningsmetod för att upptäcka och typning av norovirus. Denna metod har validerats under flera norovirusutbrott. Protokollet omfattar 1) hur man samlar pinnprover från miljöytor (2) hur man bäst upprätthålla integriteten hos proverna under insamling och transport till laboratoriet, och 3) laboratorietester och typning av norovirus.

Protocol

1. Swab Provtagning i fält Använd en ren par handskar. Mäta storleken på provytan utan att röra vid ytan med hjälp av ett måttband eller linjal. Försöka uppskatta det område som så exakt som möjligt och fyller i ett formulär (Supplementary Tabell 1). Kontrollera pinnen kit för eventuella läckage och etikett provtransportväskor och pinnsatser. Flytta pinnen tvärs över provtagningsområdet på följande sätt: en stroke i horisontell riktning, en …

Representative Results

Figur 1 presenterar ett flödesschema över svabben provtagningsprotokoll. Detta protokoll består av fyra huvudsteg; 1) provsamling, 2) prov lagring och transport, 3) viralt RNA rening och koncentration och 4) RT-qPCR analys och genotypning. Figur 1: Flödesschema i slutprotokollet för miljö yta provtagning av norovirus …

Discussion

Norovirus har en 50% humant smitt dos mellan 18 och 10 ^tre viruspartiklar ^20. Därför kan även smitta låg nivå av ytor utgör en risk för folkhälsan. Flera aspekter av pinnen provtagningsprotokoll utvärderades inklusive: 1) olika pinn material, 2) lagring skick kompresser under transport, 3) viralt RNA-koncentrationen, och 4) colifag MS2 som intern extraktion kontroll.

Tills nyligen hade endast resultatet av kompresser gjorda av bomull, polyester, ny…

Materials

Generic name for kits
Macrofoam swab	Premoistened EnviroMax Swab kit	Puritan	2588060PFUW
RNA Lysis buffer	CDC UNEX buffer	Microbiologics	Cat No MR0501
RNA extraction spin column	Midi column	Omega Biotek	Cat No R6664-02
RNA purification spin column	Zymol RNA Clean and Concentrator kit	Zymo Research	Cat No R1016
Real time RT-PCR kit	AgPath kit One-Step RT-PCR Kit	Life Technologies	Cat No 4387391
Conventional RT-PCR kit	Qiagen one step RT-PCR kit	Qiagen kit	Cat No 210212
Gel extraction kit	Qiagen QIAquick gel extraction kit	Qiagen kit	Cat No 28704 or 28706
	Coliphage MS2	ATCC	Cat No 15597-B1
	RNA run-off transcripts			Bacteriophage MS2 (ATCC No. 15597-B1) can be cultivated using Escherichia coli (E.coli) Famp (ATCC No. 700891).
	Realtime PCR platform	Applied Biosystems	Model ABI 7500	GI and GII RNA run off transcripts were quantified spectrophotometrically at A260, diluted in diethyl pyrocarbonate-treated water to 1 × 106 copies/ μl, and stored at −80°C with 1.0 U /μl RNasin (Promega, Madison, WI).
	Optical 96-well reaction plate	Thermo Scientific	Cat No 4316813
	MicroAmp Clear Adhesive Film	Thermo Scientific	Cat No 4306311