Desenvolvimento de um sistema de entrega de DNA Economical por "Acufection" e sua aplicação à Skin Research

Summary

Este protocolo é uma alternativa de custo eficaz para a expressão de ADN de plasmídeo despido na pele do rato. O objectivo geral do protocolo é a entrega de genes imuno-relacionados no tecido da pele para delinear o papel funcional de um gene específico em inflamação cutânea.

Abstract

A desregulação da resposta imune em pele está associado com numerosas desordens da pele humanos. transferência directa de genes imuno-relacionados no tecido da pele é uma abordagem fascinante para investigar a modulação imune de inflamação cutânea em modelos de ratinho de doenças humanas. Aqui apresentamos um protocolo de baixo custo que entregue DNA nu na pele do rato e leva a expressão do transgene. O método é cunhado "acufection", que denota ADN mediada por punção trans fecção acu. Para realizar acufection, pele de ratinho foi infundido em primeiro lugar com ADN em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois picado levemente com um feixe de agulhas de acupunctura para facilitar a absorção de ADN e transfeco em culas. O DNA de plasmídeo é presumivelmente retomado pelo queratinócitos e células dendríticas (DC) na pele e expressa em proteína. Picada mecânica com o agulhas per se não causar danos à pele ou induzir a ativação de queratinócitos. A expressãodos genes transfectados foi detectado na pele, tanto a nível da transcrição e tradução seguintes acufection durante 2 dias e mantiveram-se a 7 dias. O objectivo principal para o desenvolvimento deste método acufection foi investigar uma isoforma anteriormente indefinido de IL-15. Usando este método, um splicing alternativo de IL-15 isoforma com remoção parcial do exão 7 (IL-15ΔE7) foi expressa na pele e subsequentemente tratado com um receptor de tipo Toll 7 (TLR7) agonista, imiquimod (IMQ), para induzir a inflamação. Acufection-entregue IL-15ΔE7 na pele suprimiu a proliferação de queratinócitos, a espessura da epiderme e o recrutamento de neutrófilos na inflamação cutânea induzida por IMQ. Com o aumento do interesse em identificar os mecanismos de regulação da inflamação cutânea, o protocolo aqui descrito proporciona um custo alternativo eficaz e versátil para o sistema de canh de genes ou microdispersão para entrega de ADN in vivo. Ele pode potencialmente permitir a descoberta da função de um romancegene na pele ou para a investigação de novos tratamentos para doenças cutâneas.

Introduction

A pele é a primeira linha de defesa do hospedeiro. Os queratinócitos (KCs) são o tipo de célula principal na pele de seres humanos e ratinhos. Em resposta a estímulos ambientais (por exemplo, luz solar, oxigénio, produtos químicos e invasão patogénico), KCs são activados e produzir uma vasta gama de citocinas prinflamatias e quimiocinas, tais como IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF- α e GM-CSF ^1. Juntos, desencadear o recrutamento de células do sistema imunológico para a pele. Inflamação cutânea agravada é muitas vezes associada com numerosas doenças humanas, incluindo a dermatite de contacto ectópico aguda e inflamação mediada por células....

Protocol

ratinhos fêmea, com 8 - 12 semanas de idade foram usados ​​para este estudo. C57 / BL6 de tipo selvagem (WT) e IL-15 deficientes (IL-15 ^{- / -)} foram adquiridos a partir de National Center Animal Laboratory (NLAC), Taiwan e Taconic Farm, respectivamente. -IL-15 deficientes (IL-15 - / -) e IL-15 dominante (+/- IL-15 e IL-15 + / +) mostrou uma proporção de 1: 3 na segunda geração a partir do cruzamento de heterozigotos de IL-15 +/-. O genótipo de IL-15 - / - ratos foi confirmada por análise de PCR. Camundongos foram mantidos na instalação Specific Pathogen gratuito (SPF) no Laboratório animal Center (LAC),....

Results

Enquanto alguns vermelhidão foi evidente durante a primeira hora depois da punção com agulhas de acupunctura, a pele foi afastada no dia 2, e não se observou qualquer reacção adversa da pele até ao dia 7 após repicagem (Figura 2A). Agulha de perfuração induzida nível muito baixo de ortoceratose epidérmica e dérmica infiltração mínima por meio de análise de H & E em comparação com a pele não tratada (Figura 2B). A espessura d.......

Discussion

A etapa mais crítica para assegurar a expressão do DNA de plasmídeo acufected é a oscilar de forma uniforme e soltar a camada córnea da pele. Ao empurrar as agulhas suavemente sem cortar a pele, a força deve ser forte o suficiente para deprimir a superfície. Para facilitar a absorção de ADN em 10 de soluo de em um 1 cm x 1 centímetro a área de superfície, as agulhas devem oscilar para cima e para baixo para cerca de 100 vezes em 30 s. Pode-se determinar a força que tem de picar a pele e anotando o número de vezes que é .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accu Handy Needle	Accu	36Gx0.5	Dispositivo médico
NairTM Loção	Igreja & Dwight	N/A	Use para remover o cabelo
Shandon Substituto de xilina	Thermo Fisher Scientific	6764506	Desparafinização
Avertin (2,2,2-Tribromethanol)	Sigma-Aldrich	T4,840-2	Anestesia
2-metil-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Solvente para a dissolução de avertin
DifcoTM LB caldo, Miller	BD	244620	Propagação e manutenção de E. coli para biologia molecular
Kit ELISA Ready-SET-Go complexo de camundongo IL-15/IL-15R	eBioscience	88-7215	Medir proteína IL-15
Anti-camundongo Ly6G	BioLegend	127601	Anticorpo usado para coloração imuno-histoquímica
anti-camundongo Ki-67	eBioscience	14-5698-80	Anticorpo usado para coloração imuno-histoquímica
Coloração simples Mouse MAXPO (Rato)	Nichirei Biosciences	414341F	Reagente para bloquear o sinal de fundo na coloração de camundongo
para camundongo Kit de substrato DAB Peroxidase (HRP)	Vector Laboratories	SK-4100	Substrato de peróxido para coloração imuno-histoquímica
Bloco Ultra V	Thermo Fisher Scientific	TA-060-UB	Reduzir coloração de fundo inespecífica
Metil verde	Sigma-Aldrich	M8884	Coloração nuclear
Vecta MountTM	Vector Laboratories	M-5000	Preservando permanentemente as manchas histoquímicas Comprimidos
de coquetel inibidores de protease	Roche	04-693-116-001	Inibe a atividade da protease no lisado celular
Aldara creme	3M Parmaceuticals	N/A	5% imiquimod creme
Bessman Tissue Pulverizer	Spectrum Labs	189475	Use para pulverizar o ciclador de ABI7900HT de tecido da pele
	Thermo Fisher Scientific	N/A	ensaio de PCR quantitativo em tempo real
	Filmadora Panasonic	HDC-SD60	Documentação de imagem
Axio Scope.A1	ZEISS	N/A	Microscopia de campo claro