تنوعا تصاعد الطريقة على المدى الطويل التصوير التنمية الزرد
Summary
Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.
Abstract
الأجنة الزرد توفر نظام تجريبي مثالي لدراسة عمليات التخلق معقدة نظرا لسهولة الوصول من والشفافية البصرية. على وجه الخصوص، واستطالة مؤخرة الجسم هي عملية أساسية في التطور الجنيني الذي تشوهات الأنسجة متعددة تعمل معا لتوجيه تشكيل جزء كبير من محور الجسم. من أجل مراقبة هذه العملية على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير من الضروري الاستفادة من تقنية متزايدة على أن يسمح الدعم الكافي للحفاظ على عينات في الاتجاه الصحيح أثناء نقلها إلى المجهر والاستحواذ. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تصاعد أيضا توفير حرية كافية الحركة للنمو في المنطقة مؤخرة الجسم دون التأثير على تطورها الطبيعي. وأخيرا، يجب أن يكون هناك درجة معينة في براعة طريقة التركيب للسماح التصوير في التصوير المتنوعة مجموعة عمليات. هنا، نقدم تقنية متزايدة لتصوير تطوير الخلفي الجسم elongatioن في الزرد D. rerio. وتنطوي هذه التقنية المتزايدة الأجنة بحيث مناطق الرأس والكيس المحي مدرجة بالكامل تقريبا في الاغاروز، بينما تترك خارج المنطقة مؤخرة الجسم إلى استطال وتتطور بشكل طبيعي. سوف نظهر كيف يمكن تكييفها لتستقيم، مقلوب والرأسي للضوء ورقة المجهر مجموعة عمليات. في حين يركز هذا البروتوكول على تصاعد الأجنة للتصوير لمؤخرة الجسم، ويمكن بسهولة أن تتكيف لتصوير حي من جوانب متعددة للتنمية الزرد.
Introduction
الخلفي الجسم استطالة عملية أساسية في التطور الجنيني الذي الجنين يمتد لتشكيل جزء كبير من محور الجسم. إنه مثال لعملية التخلق المعقدة التي السلوكيات خلايا متعددة تعمل coordinately لتوليد التشكل على مستوى الأنسجة الفردية. هذه التشوهات الأنسجة التفاضلية ثم تعمل معا لتوليد استطالة من مؤخرة الجسم على مستوى الهيكل كله. ولكي نفهم كيف يتم التحكم في هذه العمليات وتنسيقها خلال التنمية، يجب أن تكون قادرة على متابعة هذه العمليات على مستويات متعددة (أي على مستوى الجزيئات والخلايا والسكان والأنسجة الخلية) وربط هذا مباشرة إلى التشكل من هيكل كامل .
الأجنة الزرد مثالية للتصوير الخلفي الجسم استطالة كما شفافيتها البصرية وحجم صغير يسمح لتطبيق التصوير ضوء مينيملي نهج مناسبة تماما لليفالبريد التصوير. (1) وقد تجلى ذلك من خلال سلسلة من المنشورات الحديثة التي تسلط الضوء على تطور الجسم الخلفية على مستوى الجزيئات، 2 الخلايا واحد و 3 و بين الأنسجة السلوكيات، 4 وكذلك على مستوى السكان الخلايا والجهاز كله. 5
تقنيات التصوير المتقدمة مثل متحد البؤر، المجهري متعددة الفوتون وطائرة انتقائية إضاءة المجهر (SPIM) وتمكن من التصوير على المدى الطويل من العمليات التنموية مع انخفاض تأثير سمية الخفيفة والصور وتبييض. مطلوبة تقنيات قوية لاقامة عينات حية لتحقيق ثلاثة أهداف: 1) الدعم الكافي للحفاظ على عينات في الاتجاه الصحيح أثناء نقلها إلى المجهر وخلال الاستحواذ، 2) حرية كافية للحركة من العينة للسماح ثمرة المنطقة مؤخرة الجسم دون التأثير على جمعة العادياإلمنائية، وأخيرا 3) درجة معينة في براعة طريقة التركيب للسماح التصوير في التصوير المتنوعة مجموعة عمليات.
هذا البروتوكول يدخل تقنية متزايدة لتصوير تطوير الزرد D. rerio. وتنطوي هذه التقنية المتزايدة الأجنة بحيث مناطق الرأس والكيس المحي مدرجة بالكامل تقريبا في الاغاروز، في حين ترك المنطقة مؤخرة الجسم إلى استطال وتتطور بشكل طبيعي. على هذا النحو، بل هو أيضا وسيلة مناسبة للتصوير على المدى الطويل من مناطق أخرى من الجسم النامية في الاغاروز يمكن التصوير من خلال تقنيات ضوء التصوير القياسية. هذا البروتوكول يوضح تصاعد الأجنة في اتجاه جانبي، على الرغم من أنه من الممكن أيضا إلى جبل الأجنة في توجهاتها بديل. وسوف تظهر كذلك كيف للتكيف مع أسلوب الاجهزة المجهر الخفيفة ورقة تستقيم، مقلوب والرأسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتمكن هذه التقنية المتزايدة الأجنة أن تبقى تزال أثناء نقلها إلى المجهر وعلى المدى الطويل التجارب الوقت الفاصل بين التصوير تستهدف التالية الخلفية استطالة الجسم على مستويات طول متعددة. وعلاوة على ذلك، فمن تنوعا لأنه يتيح للتصوير على حد سواء وتستقيم المقلوب المجهر مج?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Téléthon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.
Materials
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
Referências
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
- Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction. PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Schröter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).
