שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה
Summary
Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.
Abstract
עוברי דג זברה להציע מערכת ניסיונית אידיאלית ללמוד תהליכים מורכבים המוךפו"גנטי שהולכים בשל קלויות נגישות ושקיפות אופטית שלהם. בפרט, התארכות גוף האחורי הוא תהליך חיוני בהתפתחות עוברית שבאמצעותו דפורמציות רקמות מרובות לפעול יחד כדי לכוון את ההיווצרות של חלק גדול של ציר הגוף. על מנת להתבונן בתהליך זה על ידי הדמיה לטווח ארוכת זמן לשגות יש צורך לנצל טכניקת הרכבה המאפשרת תמיכה מספקת כדי לשמור על דגימות בכיוון הנכון במהלך העברת המיקרוסקופ והרכישה. בנוסף, ההרכבה חייבת גם לספק חופש מספיק תנועה של התולדה של אזור הגוף האחורי מבלי להשפיע ההתפתחות התקינה שלו. לבסוף, חייב להיות מידה מסוימת ב צדדי של שיטת ההרכבה לאפשר הדמיה על סט-אפ הדמיה המגוון. כאן, אנו מציגים טכניקת הרכבת הדמיה בפיתוח elongatio גוף האחוריn של דג הזברה ד rerio. טכניקה זו כרוכה הרכבה עוברת כך אזורי צק הראש והחלמון כמעט כלולים כולו agarose, ומותיר מחוץ לו באזור הגוף האחורי להאריך ולהתפתח באופן תקין. אנו נראים כיצד זה יכול להיות מותאם עבור קופצים להגדיר מיקרוסקופ זקוף, הפוך ואנכי אור גיליון. בעוד פרוטוקול זה מתמקד הרכבה עוברת הדמיה של הגוף האחורי, זה יכול בקלות להיות מותאם עבור הדמית החיה של היבטים רבים של פיתוח דג זברה.
Introduction
התארכות גוף האחורית היא תהליך חיוני בהתפתחות עוברית שבאמצעותו העובר משתרע מהווה חלק גדול של ציר הגוף. זוהי דוגמא של תהליך מורכב המוךפו"גנטי שהולך שבאמצעותו התנהגויות תאים מרובות לפעול בצורה מתואמת כדי ליצור את morphogenesis ברמה של רקמות פרט. דפורמציות רקמות הפרש אלה ולאחר מכן לפעול יחד כדי ליצור את ההתארכות של הגוף האחורי ברמת המבנה כולו. כדי להבין כיצד תהליכים אלה נשלטים ומתואמים במהלך פיתוח, אנחנו חייבים להיות מסוגלים לעקוב אחר התהליכים האלה בקני מידה מרובות (כלומר ברמה של מולקולות, תאים, אוכלוסיות תאים ורקמות) ולהתייחס זה ישירות morphogenesis של המבנה כולו .
עוברי דג זברה הם אידיאליים עבור התארכות גוף אחורי הדמיה כמו השקיפות האופטית שלהם והגודל קטן מאפשרים ליישום הדמית אור פולשנית מתקרבים גם מתאים ליבהדמית דואר. 1 זה כבר שמעיד סדרת הפרסומים האחרונים כי שפכו אור על התפתחות גוף אחורית ברמה של מולקולות, 2 תאים בודדים, 3 והתנהגויות בין רקמות, 4 וכן ברמה של אוכלוסיית תא כולו איברים. 5
שיטות הדמיה מתקדמות כגון confocal, מיקרוסקופיה-פוטון רב מיקרוסקופיה תאורת מטוס סלקטיבית (SPIM) מאפשרות הדמיה לטווח הארוך של תהליכים התפתחותיים עם ירידת ההשפעה רעילה אור צילום לבן. טכניקות חזקות עבור ההרכבה של דגימות חיות נדרשות להשיג שלוש מטרות: 1) תמיכה מספקת כדי לשמור על דגימות בכיוון הנכון במהלך העברה המיקרוסקופ במהלך רכישה, 2) חופש מספיק תנועה של המדגם כדי לאפשר את התולדה של באזור הגוף האחורי מבלי להשפיע devel הרגילopment, ולבסוף 3) במידה מסוימת ב צדדי של שיטת ההרכבה לאפשר הדמיה על סט-אפ הדמיה המגוון.
פרוטוקול זה מציג טכניקת הרכבת הדמיה בפיתוח של דג הזברה ד rerio. טכניקה זו כרוכה הרכבה עוברים כך אזורים שק ראש וחלמון כמעט כלולים כולו agarose, תוך השארת באזור הגוף האחורי להאריך ולהתפתח באופן תקין. ככזה, הוא גם בשיטה מתאימה ההדמיה לטווח הארוך של אזורים אחרים בגוף מתפתח כמו agarose מאפשר הדמיה על ידי שיטות הדמית אור רגילות. פרוטוקול זה מדגים הרכבה של עוברים בכיוון לרוחב, אם כי אפשר גם לעלות עוברים אוריינטציות alterative. עוד יציגו כיצד להתאים את השיטה עבור זקוף, פנימה ובמאונך setups מיקרוסקופ אור גליון.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקה זו מאפשרת הרכבה עוברת להישמר עדיין במהלך העברת המיקרוסקופ ושוב לטווח ארוך ניסויי הזמן לשגות הדמיה שמטרתה הבאה התארכות גוף אחורית בסקאלות אורך המרובה. יתר על כן, זה הוא תכליתי בכך שהיא מאפשרת הדמיה משני מיקרוסקופיה זקוף הפוך בחרו קופץ, וכן המלצה ניתנת למען איך …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Téléthon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.
Materials
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
Referências
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
- Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction. PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Schröter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).
