斑马鱼发展长期成像的多功能安装方法
Summary
Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.
Abstract
斑马鱼胚胎提供了一个理想的实验系统来研究复杂的形态发生过程，由于其方便可及性和光学透明性。特别是，后体伸长是在胚胎发育，使多个组织变形一起作用以引导体轴的一个大的部分形成一个基本过程。为了通过长期延时成像观察这一过程，有必要利用一个安装技术，允许足够的支撑，以传递到显微镜和采集过程中保持在正确的方向的样品。此外，安装也必须提供为后体区的生长移动的足够的自由度，而不影响它的正常发育。最后，必须有一定程度的安装方法，允许在不同的影像调校成像的多功能性。在这里，我们提出了一个安装技术成像后身体elongatio发展N的斑马鱼斑马鱼D.。该技术包括安装胚胎，使得头部和卵黄囊区域几乎完全包含在琼脂糖，而留下了后体区伸长和正常发育。我们将展示如何能够适应直立，倒立和垂直光表镜调校。虽然该协议的重点是安装胚胎的体内后成像，它可以很容易地适应的斑马鱼发育的多个方面的实时成像。
Introduction
后体伸长是在胚胎发育的基本过程，其中胚胎延伸以形成体轴的很大一部分。它是一个复杂的形态发生过程，其中多细胞行为起作用协调以产生个体组织的水平的形态的一个例子。这些差分组织变形然后一起作用在整个结构水平，以产生后验体的延伸率。要了解这些过程是如何被控制和开发过程中的协调，我们一定能够按照这些流程在多尺度（ 即在分子，细胞，细胞群体和组织的水平），并直接将之与整个结构的形态。
斑马鱼的胚胎是理想的成像后的身体伸长其光学透明性和小尺寸允许微创光成像的应用方法很适合于LIVË成像。 1这已通过一系列最近的出版物中，在分子的水平已经阐明后身体发展光证明，2个单细胞，3和组织间的行为，4以及在细胞群体和整个器官的水平。 五
先进的成像技术如共焦，多光子显微术和选择性平面照明显微镜（SPIM）正在使发育过程的长期成像降低光毒性和光致漂白的效果。活样品的安装鲁棒技术，以实现三个目标是必需的：1）足够的支持，以转移到显微镜和采集期间过程中保持在正确的方向的样品，2）样品的运动的足够的自由度以允许的生长在不影响其正常DEVEL后部本体区域opment，最后3）在一定程度上的安装方法的通用性，允许在不同的影像调校影像。
此协议引入了成像斑马鱼D.鱼发展的安装技术。该技术包括安装胚胎，使得头部和卵黄囊区域几乎完全包含在琼脂糖，而留下的后体区伸长和正常发育。因此，它也是对显影体的其他区域的长期成像作为琼脂糖使得能够通过标准的光成像技术成像的适当的方法。这个协议演示安装在横向取向的胚胎的，虽然它也可以安装在变质取向胚胎。它将进一步展示如何适应直立，倒立和垂直光表镜的设置方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
这种安装技术使得胚胎转移到显微镜和目的是在多尺度下后身体伸长了长期的时间推移成像实验过程中仍然保持。此外，它是通用的，因为它允许在两个直立和倒置显微镜调校成像和一个建议是为如何可以进一步适于垂直取向SPIM制成。
在本协议中的一个关键步骤是仔细去除周围后身体即允许这种结构的正常发展的重要多余的琼脂糖。除去周围的蛋黄的顶部琼脂糖特别是当在?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Téléthon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.
Materials
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
Referências
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
- Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction. PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Schröter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).
