Ett optimerat protokoll för mognaden av zebrafisk oocyter som används för manipulering av matemella genprodukter in vitro presenteras här.
Cellulära händelser som äger rum under de tidigaste stadierna av animaliskt embryonal utveckling drivs av maternella genprodukter deponeras i utvecklings äggcellen. Eftersom dessa händelser är beroende av moderns produkter som normalt fungerar mycket snart efter befruktningen, som preexist inne i ägget, standardmetoder för uttryck och funktionsnedsättning som innebär injektion av reagens i det befruktade ägget är vanligtvis ineffektiva. I stället måste sådana manipulationer utföras under oogenes, före eller under ansamling av moderns produkter. Denna artikel beskriver i detalj ett protokoll för mognaden in vitro av omogna zebrafisk oocyter och deras efterföljande in vitro-fertilisering, vilket gav viabla embryon som överlever till vuxen ålder. Denna metod tillåter den funktionella manipulering av maternella produkter under oogenes, såsom uttrycket av produkter för fenotypisk räddning och taggade konstruktet visualisering, samt ens minskningen av genfunktionen genom omvända-genetik medel.
Under djurutveckling, moder insättningar genprodukterna (t ex RNA, proteiner och andra biomolekyler) i ägget; dessa produkter är viktiga för tidiga cellulära processer omedelbart efter befruktning 1, 2. Manipulation av uttryck och funktion av moderns produkter är typiskt ineffektiva vid användning av en standardiserad metod för insprutning av reagens in i befruktade ägg 3. Detta eftersom de flesta RNA och proteiner produceras av äggcellen under oogenes, så förinstallerade moderns produkter finns redan i den mogna ägg. Sådana redan existerande produkter är ogenomträngliga för funktionell knockdown med genen målsökande medel, såsom morfolino antisensoligos (MOS), eftersom MO: rikta mRNA, inte den tidigare existerande protein som redan finns i ägget vid befruktning. Dessutom har många tidiga embryonala processer sker för tidigt efter befruktningen att influenced av proteinprodukter som härrör från RNA injiceras i det befruktade ägget, som RNA inte kan produceras tillräckligt snabbt för att påverka de första händelserna i embryogenes. Av samma skäl, märkt proteinfusioner som uttrycks genom en mRNA injektion i det befruktade ägget kan inte framställas i tid för visualisering under deras aktiva roll i det tidiga embryot. Injektion i extruderade mogna oocyter före ägg aktivering är möjlig men är associerad med liknande tekniska frågor: sådana mogna ägg är redan förinstallerad med maternal protein, och de kommer inte att bli translatoriskt aktiv (dvs producera protein från exogena transkript) tills efter ägg aktivering. Av dessa skäl måste manipulation av moderns genprodukter verkar i början av embryogenes typiskt utföras under oogenes i mognande äggcellen.
Som ett tillvägagångssätt för att övervinna dessa hinder, in vitro-mognads metoder, som möjliggör för mognaden av OOCytes från steg IV till ägg bildning, har etablerats i zebrafisk. Tidiga metoder tillåts in vitro mognad, men de resulterande mogna äggen var inte kompetent för befruktning 4. Därefter manipulation av odlingsbetingelser från neutralt till pH 9,0, imitera det alkaliska pH-värdet i äggstocks fluiden som finns i fiskarter 5, 6, tillåts för tillförlitlig in vitro-fertilisering (IVF) efter in vitro-mognad 7, 8. I själva verket kan in vitro -matured oocyter ge livsdugliga embryon som överlever till vuxen ålder och som är fertila 3, 8. Detta förbättrade förfarande har vidare anpassas för att inkludera den funktionella manipulation av maternella gener, uttryckningen av märkta proteiner under zebrafisk oogenes genom exogen expression, och MO-medierad funktionell slå ner i mattannder steget IV oocyter 3 (Figur 1).
Zebrafisk oogenes uppvisar ett antal karakteristiska steg som leder till bildningen av mogna oocyter 9 (se tabell 1 för en sammanfattning av de olika stegen i oogenes). I korthet är äggcellen utveckling initieras av steg I äggceller och greps vid diplotene skede av profas I av meios. Dessa oocyter undergår tillväxt genom aktiv transkription (initieras under stadier IA och IB), bildandet av kortikala alveoler (även känd som kortikala granuler, som initierades under steg II), och vitellogenesis (initierats under steg III). Oocyt tillväxten är avslutad under steg IV, när meios I återupptas, vilket resulterar i demontering av oocyten kärnan, hänvisad till som den germinala vesikeln (GV). Därefter är meios greps igen på metafas II. Fullbordandet av oocyt tillväxt och meiotiska stillestånd under steg IV leder till ett moget stadium V t.ex.g 9. Avlägsnandet av den follikulära membranet inträffar under frisättningen av oocyten in i lumen av äggstocken 10 och är nödvändig för befruktning och korrekt ägg aktivering. När äggen extruderas från modern under naturlig parning blir de aktiveras. I zebrafisk, är exponering för vatten som är tillräcklig för full ägg aktivering, oavsett närvaron av spermier 11.
In vitro-villkor som för närvarande gör det möjligt att mognaden av oocyter från tidigt stadium IV-som kan kännas igen av deras storlek (690-730 um), närvaron av ett stort GV i en asymmetrisk position och en fullt opakt utseende på grund av ansamling av äggula proteiner (Figur 2B) -till det mogna stadiet V ägg, kännetecknad av en fullständigt demonteras GV och ett genomskinligt utseende på grund av äggula proteinbearbetning 12 (figur 2C). I detta tillvägagångssätt, hela äggstockar fortsaining oocyter i olika stadier av utveckling avlägsnas från honor. Oocyterna får utvecklas i 17α-20β-dihydroxi-4 pregnen-3-on (DHP), en effektiv mognad framkallande hormon 8. Under denna period, kan förfall oocyter manipuleras genom insprutnings av uttryck (t ex, capped, in vitro -transcribed mRNA) eller omvänd genetik medel (t ex MOS). Den follikulära skiktet inte spontant skjul mot slutet av mognadsperioden, så det måste avlägsnas manuellt. Efter defolliculation, är in vitro fertilisering uppnås genom att utlösa ägg aktivering genom exponering av äggen till vatten (närvarande i embryonal (E3) medium) 13 och en spermielösning. De resulterande zygoter genomgår embryonal utveckling och göra det möjligt att utvärdera möjligheten för behandlingar för att manipulera moderns geners funktion och för visualisering och analys av märkta maternella produkter ( <strong> Figur 3).
Protokollet ovan är för manipulering av genprodukter före befruktning, vilket möjliggör studier av matemella genprodukter i början zebrafisk embryot. Tidigare studier har kunnat mogna äggceller in vitro 4; detta protokoll modifierades för att möjliggöra för den efterföljande fertilisering av in vitro-mognade oocyter 8. Detta i sin tur gör det möjligt för injektion av reagens för funktionell manipulation och visualisering av maternellt ärvda produkter i tidiga embryot 3. Embryon som härrör från denna metod kan vara livskraftig och kan överleva att bli fertila vuxna. I preliminära experiment, ungefär hälften av de befruktade embryon från detta förfarande var lönsamt på dag 5 av utveckling, som bedöms av simblåsan inflation i detta skede, varav ungefär hälften blev friska, fertila vuxna (opublicerade observationer).
Det finns ett antalkritiska steg att tänka i protokollet. Oocyter vid lämplig tidpunkt för att initiera mognad (tidigt stadium IV) kan berikas om den kvinnliga har parat nyligen, men inte före den 8 DPP. Använda fisk som inte har parat nyligen kan resultera i degenererade ägg 14, som inte kommer att genomgå mognad. Kvinnor parade inom mindre än 8 dagar kommer att ha en majoritet av ägg i stadium III eller mindre, och därmed kommer äggen inte mognar på rätt sätt in vitro. Äggstockar hos honor som parat 8 dagar före kommer att ha en optimal fraktion av oocyter i tidigt stadium IV. Dessa kan kännas igen av deras opacitet och närvaron av GV i ett excentriskt läge (Figur 2B). Oocyt steget bestämning kan också underlättas genom storleksmätning, med oocyterna placerades på en graderad mikrometer glider under ett mikroskop och jämfört med standard riktlinjer mellanstationer (tabell 1). Men tidigt stadium IV äggceller har nästan maximal storlek jämfört med mognaoocyter (känns igen av deras relativa transparens och bristen på en GV; Figur 2C) och är lätt att känna igen, såsom beskrivits ovan, som i allmänhet undanröjer behovet av en direkt mätning oocyt storlek.
In vitro mognad måste börja inom några timmar efter utgången av dagsljus cykel som de kvinnliga äggcell givare acklimatiserad. Oocyter inte mogna ordentligt, återspeglas i fattiga befruktning priser, om odlas under perioden av ljuset cykeln morgonen. Orsaken till den cirkadiska beroende av in vitro oocytmognad metoden är inte klarlagd, men återspeglar sannolikt underliggande dygnsrytm fördomar i in vivo äggmognad involverar cykling genexpression under oogenes 21. En vanlig orsak till äggceller misslyckas att genomgå framgångsrik in vitro mognad trots korrekt äggcellen iscensättning är att DHP har löpt ut. DHP hormon upphör vanligen efter ett år, och för att säkerställa effektIve mognad bör arbets partiet bytas ut inom 9 månaders användning.
Injektion av oocyter är ett annat kritiskt steg när syftet med förfarandet är den funktionella manipulation av maternella produkter. Detta förfarande har krav som skiljer sig från dem för standard injektioner i det befruktade ägget vid 0-30 MPF. En viktig faktor för oocytinjektion är behovet av att utföra injektionerna under betingelser som inte leder till för tidig ägg aktivering, såsom i Leibovitz L-15-medium 22, 23. Eftersom de är inbäddade i äggstockarna, som förfaller äggceller utgör också särskilda utmaningar injektion. Protokollet ovan antyder först dissociera oocyter från äggstockarna och sedan hålla varje dissocierade oocyt separat med pincett under injicering. Denna teknik har fungerat bra och låter försortering äggceller vid lämplig tidpunkt med minimal hantering. Alternativa metoder kan också användas, såsomsom: i) placera oocyter till standard injektion rännor agaros 15, där de vertikala väggarna hos tråget stöd oocyten under injektion (i denna alternativa metod, oocyterna måste överföras till injektionsplattor medan hålls i in vitro-mognadsmedium) och ii ) låta oocyterna att förbli fäst vid den ovarian massa, som kan hållas med pincett under injektionen för att undvika kontakt med den injicerade oocyten (i detta tillvägagångssätt bör oocyterna dissocieras efter injektionen för att både underlätta DHP exponering och för att tillåta deras defolliculation , i sig väsentligt för IVF). Trots denna specifika utmaning, kan steg IV oocyter lätt penetreras med en injektionsnål, sannolikt eftersom den chorionic membranet vid detta stadium inte är fullt utvecklad 9.
En begränsning av den aktuella mognadsprotokollet är att in vitro mognads förhållanden som främjar korrekt äggcellen utvecklingkan inte skapas när oocytmognad initieras vid steg tidigare än steg IV. Oocyter bli behöriga att svara på DHP genom att genomgå mognad när de når en diameter av 520 um, som sker under steg III (vitellogenesis, motsvarande den 340-till-690-pm-området) 9. Men kultur stadium III oocyter resulterar i oocyter som inte är behörig för befruktning 3. Endast oocyter vars in vitro-odling initieras vid steg IV (Figur 2B) kan utvecklas till mogna, stadium V oocyter (Figur 2C och D). Detta kan bero på det faktum att steg III är viktigt för vitellogenesis och äggcellen tillväxten 9. Sålunda bör den vitro förfarande oocytmognad de presenteras i denna artikel endast användas med en utgångspopulation av steg IV oocyter (B), och inte med oocyter vid tidigare stadier (stadium I – III; Figur e <strong> 2A). Av samma skäl är detta förfarande begränsat till gener som uttrycks vid steg IV eller senare. Den funktionella manipulation av gener vars produkter uttrycks tidigare kan istället förlita sig på genetiska metoder (se nedan). Förbättringar av in vitro-odling mognads metoder kan i framtiden göra det möjligt att inleda äggcellen odling vid tidigare stadier, vilket utökar kraften i in vitro-mognad tillvägagångssätt.
En annan begränsning i det presenterade förfarandet är att defolliculation, som är väsentlig för de efterföljande stegen som involverar befruktning, är för närvarande ett hastighetsbegränsande steg i förfarandet. Den follikulära membranet är ett transparent skikt som omger den utveckla oocyt, och borttagning kan vara långtråkig. Om detta membran inte är helt bort, kommer ägget inte bli helt aktiverad och befruktas. Detta görs tydligt genom misslyckandet med chorion att expandera och utveckla oregelbundet placerade, fåra liknande structures (pseudocleavages), som är karakteristiska för obefruktade embryon 11. Enzymatiska defolliculation metoder såsom kollagenas, som användes i Xenopus har prövats. Men i våra händer, denna teknik har inte varit framgångsrik, och förlitar vi därför manuellt defolliculation. Eftersom manuell defolliculation är arbetsintensivt och tidskrävande, är det svårt att få stora partier av befruktade ägg efter in vitro oocytmognad. På grund av den tidsmässiga begränsningen genom manuell defolliculation vi för närvarande befrukta några defolliculated, mogna ägg i taget, i små partier av 5-10 ägg. Införlivandet av enzymatisk defolliculation med detta förfarande skulle sannolikt avsevärt öka dess utbyte och allmänt enkel användning.
Även embryon som producerats efter befruktning in vitro -matured äggceller kan bli livskraftiga vuxna, kan vi konstatera att efter provrörsbefruktning, en bråkdel av embryon gör inte dela normalt eller i tid. Vi för närvarande väljer för linjer vilkas förökning inkluderar omgångar av in vitro oocytmognad, vilket kan resultera i mer robusta utvecklingsmönster i embryon härledda genom denna metod.
Förfarandet har möjliggjort för den klara räddnings- eller visualisering av proteinlokalisering för ett antal mutationer 24, 25. För vissa gener, kan regleringen av produktexpression vara avgörande, så att produkterna uttryckta av injicerade mRNA kan leda till olika resultat 26. Det är också viktigt att vara uppmärksam på alla kontroller (t ex embryon som injicerats med reagens som har liknande egenskaper som de som används i experimentet ännu förutspås att inte producera en effekt, såsom kontroll MO eller RNA som kodar för inerta proteiner enbart, såsom som GFP), som underliggande variation kan leda till felaktiga slutsatser.
nt "> Ett tillvägagångssätt involverar in vitro-manipulation, följt av befruktning är särskilt användbar i fallet med maternellt deponerade produkter där standardmetoden för att injicera RNA, MO, eller protein i det befruktade ägget kan inte effektivt minska produkter som redan ackumulerats i ägget. andra nyligen utvecklade metoder, såsom CRISPR-mutant generation, är också effektiva på att generera mutanta förhållanden för matern uttryckta gener 26. emellertid kräver denna metod tillväxten av flera generationer av fisk. in vitro oocytmognad teknik medger snabb funktionell manipulation för att studera funktionen av maternellt uttryckta gener, inklusive räddningen och phenocopy av mödrars effekt mutationer, såväl som uttryck av RNA och proteiner i det tidiga embryot.The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka medlemmarna i Pelegri lab och fisk anläggning ledande personal, som var avgörande för att underlätta detta projekt. Stöd för detta projekt från NIH R56 GM065303 och NIH två T32 GM007133 till ELW, NIH 5 F31 GM108449-02 och NIH två T32 GM007133 till CCE och NIH RO1 GM065303 till FP
Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
CaCl2 | Sigma | C7902 | |
MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
Plastic spoon | available in most standard stores | ||
Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
Ice bucket | any maker | ||
Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
Paper towels | any maker | ||
Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
Timer stop watch | any maker | ||
Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
Leibovitz'z L-15 medium | Thermofisher | 11415064 | |
NaOH | Sigma | 221465 | for pH'ing |
BSA | Sigma | A2058 | |
17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP) | Sigma | P6285 | |
gentamicin | Sigma | G1272 | |
Injection Apparatus | Eppendorf | FemtoJet | or equivalent |
Capillary Tubing for injection needles | FHC | 30-30-1 | or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm |
Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | any maker |
Micropipetor (1-20 µl range) with tips | any maker | ||
Micropipetor (20 – 200 µl range) with tips | any maker | ||
Micropipetor (100 – 1000 µl range) with tips | any maker | ||
Conical tubes 15ml | any maker | ||
Conical tubes 50ml | any maker | ||
plastic pipette 10 ml with bulb | any maker | ||
plastic pipette 20 ml with bulb | any maker | ||
Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm | AmScope | MR095 | or equivalent |
Reagents for fish water: | |||
Instant Ocean Salt | Drs. Foster & Smith | CD-116528 | |
Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761-1KG | |
Reagents for E3 medium: | |||
NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
KCl | Sigma | P5405-500G | |
CaCl2, dihydrate | Sigma | C7902-500G | |
MgSO4, heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
Methylene Blue | Sigma | M9140-25G | |
Fish Food: | |||
Frozen brine shrimp | Brine Shrimp Direct | FBSFKG50 | |
Tetramin Flakes | Drs. Foster & Smith | 16623 |