Beredning och övervakning av Thick Biologiska Prover av Scanning transmissionselektronmikroskopi Tomography

Summary

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Abstract

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

Introduction

Sedan början av 1970-talet närmar tomografi i transmissionselektronmikroskop (TEM) har använts i stor utsträckning för den strukturella karakterisering av biologiska prover ^{1, 2, 3.} Attraktionskraften av transmissionselektron tomografi var att det kunde användas för att studera ett brett spektrum av biologiska strukturer på nanometerskala, från arkitekturen i cellerna och ultrastrukturen av organeller till strukturen av makromolekylära komplex och proteiner. Icke desto mindre skulle transmissionselektron tomografi inte användas för att studera mycket tjocka prover (större än 0,5 | j, m). Faktiskt, tjocka prover producerar för många spridda elektroner, som genererar låga signal-till-brusförhållande (SNR) bilder. Dessutom involverar tomografi insamling av bilder av tiltade exemplar, med den skenbara tjockleken hos provet ökar med snedställningsvinkeln. Även om kan filtreras inelastisk spridningmed användning av energifilter, är den kritiska mängden av elektroner som behövs för höga SNR-bilder lyckades nå i TEM. Därför har tjocka biologiska prover endast studerats med hjälp av snittning ^4.

Vissa prover kan inte skivas: vissa kan försämras om de skärs, och andra behöver studeras i sin helhet för att förstå deras komplexitet. Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda TEM i skanningsläge ^{5, 6, 7, 8.} I scanning transmissionselektronmikroskopi (STEM), är den optiska vägen för elektronerna annorlunda än i konventionella TEM. Elektroner som passerar genom provet utan spridning kan samlas på den optiska axeln med en ljusfält (BF) detektor ^9, medan de spridda elastiskt kan hämtas på en viss vinkel från den optiska axeln med en mörkfält (DF) detektor.Den andra fördelen med STEM är att den fokuserade elektronstrålen skannas på ytan av provet, vilket gör att pixel-för-pixel samling av bilderna. Även om elektronstrålen breddar samtidigt som passerar genom provet ^10, är detta särskilt insamlingssystem mindre känslig för oelastiskt spridda elektroner än konventionell TEM. Dessutom finns det inget objektiv efter förlagan i STEM, varigenom man undviker de kromatiska avvikelser som kan förekomma i TEM. Kameran Längden kan justeras så att BF detekterar huvudsakligen spritt elektroner. Använda DF detektorn att studera tjocka prover rekommenderas inte på grund av multipel spridning, vilket ger felaktiga bilder. Istället kan BF detektorn användas ^11. Medan STEM kan producera höga SNR bilder, har det en relativt låg djup-of-field på grund av den relativt höga strålen konvergens jämfört med TEM, minska mängden ingående information som kan utvinnas ur tjockprover. I fallet med aberration-korrigerade STEM mikroskop, där konvergensvinkeln kan vara så hög som 30 mrad, kan djupet fält vara tillräckligt låg så att den information som är i fokus kommer från en fokalplan endast ett fåtal nanometer . Ställa in elektronstrålen parallellt läge förbättrar djupfält av elektronstrålen på bekostnad av upplösningen ^12. Emellertid är denna installation inte alltid möjligt.

Närhelst det är nödvändigt att använda en konvergent elektronstråle, måste man använda tekniker som ökar djupet-of-field av elektronstrålen när man studerar tjocka prover. Nyligen genomförda studier har rapporterat att förvärva flera bilder på olika fokalplan hela provet för att återställa den maximala mängden i fokus information ^{13, 14.} De två studier beskriver olika sätt att hantera information från olika fokalplan. Hovden et al.kombineras i Fourier rymden bilderna som samlades in vid olika fokalplan, och den slutliga rekonstruktionen erhölls direkt från 3D inversa fouriertransformen ^13. I motsats härtill Dahmen et al. utvecklat en konvergent stråle rekonstruktion motorn rekonstruera i verkliga rymden 3D-volymen från olika fokalplan ^14. Vårt laboratorium har också utvecklat en metod för avbildning av tjocka biologiska prover. Vår strategi var skiljer sig från de två metoder som beskrivs ovan genom att vi samman den information som är i fokus i de olika fokalplan och rekonstruerade den slutliga 3D-volymen i verkliga rymden med hjälp av en parallell stråle projektorn ^15. Vårt mål var att utveckla en metod som lätt kan utföras i någon elektronmikroskopi laboratorium. För detta ändamål, som syftar vi att samla in kontaktbilder i en begränsad tid, jämförbar med tidsramen för konventionella tomografi experiment. Dessutom har våra föreslagna metoden could anpassas för användning med olika typer av anpassning och återuppbyggnad programvara.

Inom ramen för vår publikation från 2015 ^15, ville vi att visualisera och karakterisera återhämtning av djupet-of-field, så vi använde en stor konvergens halvvinkel på 25 mrad. Här presenterar vi en steg-för-steg-protokoll för att utföra genom fokus avbildning i STEM enligt den metod som utvecklats i vårt laboratorium i 2015 ^15, och presenterar vi hur data från 2015 bearbetades. Denna metod återvinner i fokus information från flera fokalplan under en tjock (750 nm) biologiskt prov och möjliggör högkvalitativa 3D-rekonstruktioner. I förekommande fall, är skillnaderna i denna metod jämfört med de metoder som används av andra grupper också presenteras.

Protocol

Varning: Se de säkerhetsdatablad (MSDS) för de olika reagenserna innan du använder dem. Flera av de kemikalier som används vid provberedningen är giftiga, cancerframkallande, mutagena och / eller reproduktionsstörande. Använd personlig skyddsutrustning (handskar, skyddsrock, full längd byxor, och sluten tå skor) och arbeta under ett dragskåp vid hantering av provet. Sektionering av provet med en ultramicrotome innebär användning av vassa instrument, och försiktig användning av dessa verktyg är obligatoris…

Representative Results

I vår studie var elektroner accelereras till 200 kV i fältemission pistolen transmissionselektronmikroskop. Bilder samlades i STEM BF läge med en 20-us uppehållstid. När det gäller utformningen av de genomgående fokus tilt-serien, fann vi att fokusintervall av 150 nm gav tillfredsställande resultat för ultra studie av en 750 nm tjock biologiskt prov, även om djupfält av elektronstrålen var bara 3 nm-eftersom vi använde en mycket stor konvergenshalvvinkel på 25 mrad. <p …

Discussion

I den här artikeln presenterar vi en konventionell provberedning protokoll tillsammans med en steg-för-steg guide för att utföra 3D analys på tjocka biologiska prover med hjälp STEM genom fokus tomografi. Harts inbäddning av biologiska prover har använts i årtionden ^26, och alternativa metoder som anpassas till olika typer av prover kan hittas i hela litteraturen ^27. Däremot imaging tjocka exemplar i STEM använder genomgående fokus metoder ett nytt företag, oc…

Materials

Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P4417
Ethanol	Sigma-Aldrich	2860
Epoxy resin	EMS	14120
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Osmium Tetroxyde	EMS	19150
Uranyl Acetate	Sigma-Aldrich	73943
Gelatin Capsule	EMS	70110
Triming and Histo knives	LFG Distribution	Diatome diamond knives
Electron Microscopy copper grid	LFG Distribution	G200-Cu
Grid Coating Pen	LFG Distribution	70624
Specimen Holder	JEOL	EM-21311 HTR
Electron Microscope	JEOL	JEM-2200FS