Um sensor baseado em Aptamer para não quelatada gadolínio (III)

Resumo

O uso de moléculas de polidesoxinucleotídeo (aptâmero de 44 meros) para detectar o íon gadolínio (III) não quelado em uma solução aquosa é descrito. A presença do íon é detectada por meio de um aumento na emissão de fluorescência do sensor.

Resumo

Um método para determinar a presença de íon gadolínio trivalente não quelado (Gd³⁺) em solução aquosa é demonstrado. O Gd³⁺ está frequentemente presente em amostras de agentes de contraste à base de gadolínio como resultado de reações incompletas entre o ligante e o íon, ou como um produto de dissociação. Como o íon é tóxico, sua detecção é de importância crítica. Aqui, o projeto e o uso de um sensor baseado em aptâmero (sensor Gd) para Gd³⁺ são descritos. O sensor produz uma mudança de fluorescência em resposta ao aumento das concentrações do íon e tem um limite de detecção na faixa nanomolar (~ 100 nM com uma relação sinal-ruído de 3). O ensaio pode ser executado em um tampão aquoso em pH ambiente (~ 7 - 7,4) em uma microplaca de 384 poços. O sensor é relativamente não reativo em relação a outros íons metálicos fisiologicamente relevantes, como íons sódio, potássio e cálcio, embora não seja específico para Gd³⁺ em relação a outros lantanídeos trivalentes, como európio (III) e térbio (III). No entanto, os lantanídeos não são comumente encontrados em agentes de contraste ou nos sistemas biológicos, e o sensor pode, portanto, ser usado para determinar seletivamente o Gd³⁺ não quelatado em condições aquosas.

Introdução

A importância crescente das imagens de ressonância magnética (MRI) em diagnóstico clínico, que é limitada pela sensibilidade inerente da técnica, resultou no rápido crescimento de investigação para o desenvolvimento de novos agentes de contraste à base de gadolínio (GBCAs ^1). GBCAs são moléculas que são administrados para melhorar a qualidade da imagem, e eles tipicamente têm a estrutura química de um ião trivalente gadolínio (Gd ³⁺⁾ coordenado a um ligando polidentado. Esta complexação é de importância crítica como D'us não quelatada ³⁺ é tóxico; tem sido implicado no desenvolvimento de fibrose sistémica nefrogénica, em alguns pa....

Protocolo

NOTA: água de qualidade para biologia molecular é utilizado em todas as preparações de amortecimento e de solução. Todos os tubos descartáveis ​​(microcentrífuga e PCR) e pontas de pipeta são DNase e RNase. Por favor consultar a folha de dados de segurança (FDS) para todos os produtos químicos antes da utilização. Uso de equipamento de proteção individual (EPI) é fortemente recomendado.

1. Preparação de Soluções de Stock aptâmero

1. Comprar 2 fios de polidesoxinucleótido comercialmente. Ordenar ambas as cadeias com purificação através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).
   Vertente 1 (Gd-aptâmero):
   5 ....

Resultados

Uma mudança de fluorescência típica da solução de Gd-sensor na presença de não quelatada ^{Gd3 +} é mostrada na Figura 2. A emissão pode ser representada graficamente como a mudança de fluorescência vezes (Figura 2A) ou a fluorescência em bruto leitura (Figura 2B) em unidades arbitrárias (AFU). Ambos os lotes se obter curvas de calibração muito semelhantes, com um intervalo linear de concentrações de Gd ³⁺ abaixo de 1 .......

Discussão

Usando o Gd-sensor baseado em aptâmero, um aumento na emissão de fluorescência que é proporcional à concentração de não quelatada ^{Gd3 +} é observada. Para minimizar a quantidade de amostra utilizada, o ensaio pode ser executado numa microplaca de 384 cavidades com um volume total de amostra de 45 uL por poço. Neste design, a escolha de fluoresceína (FAM) e dabcil (DAB) baseou-se principalmente sobre o custo dos reagentes; para modificar o comprimento de onda de emissão, um emparelhamento diferente de fluorófor.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Gd-aptâmero	IDTDNA	Sequência de entrada e modificação do fluoróforo na forma de pedido	Um fluoróforo com um comprimento de onda de emissão diferente pode ser usado. O aptâmero também pode ser encomendado a outra empresa.
Fita de têmpera	IDTDNA	Sequência de entrada e modificação do atenuador no formulário de pedido	Um atenuador diferente para transferência de energia ideal do fluoróforo pode ser usado. O aptâmero também pode ser encomendado a outra empresa.
		de grau de biologia molecular	Nenhum fabricante específico, tanto o DEPC quanto o não tratado com DEPC funcionam igualmente bem
Cloreto de gadolínio (III) anidro	Strem	936416	Tóxico
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Cloreto de magnésio anidro	MP Biomedicals	0520984480 - 100 g
Cloreto de Sódio	Acros Organics
Cloreto de potássio	Fisher Scientific	P333-500
Hidróxido de sódio, pellets	Fisher Scientific	BP359
Ácido clorídrico	Fisher Scientific	SA49	Placas NBS de
poliestireno de fundo plano preto de flange baixa de 384 poços tóxico e corrosivo Placas NBS	Corning	3575	que são adequadas para fluorescência leitura são obrigatórias.
Filtro de topo de garrafa descartável estéril Nalgene Rapid-Flow	Thermo Scientific	5680020	A tampa da garrafa está equipada com membrana PES de 0,2 mícron
Frascos estéreis descartáveis 250 mL	Corning	430281	Pode ser usada uma garrafa maior ou menor Tubos
		microcentrífuga de 1,5 mL	Nenhum fabricante específico, desde que sejam livres de DNAse e RNAse
Tubos			de PCR de 0,2 mLNenhum fabricante específico, desde que sejam Micropipetas
			Nenhum fabricante específico
Pontas de pipeta (sem filtro) de tamanhos apropriados			Nenhum fabricante específico, desde que sejam livres de DNAse e RNAse
EquipamentoLeitor de
placas	Biotek Synergy H1		Leitores de placas de outros fabricantes funcionariam igualmente bem

Água 327300025 corrosivo de livres de DNAse e RNAse