Single-celle Gene Expression Profiling Brug FACS og qPCR med interne standarder
Summary
We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.
Abstract
Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.
Introduction
Individuelle celler i en population kan vise vidt forskellige reaktioner på en ensartet fysiologisk stimulus 1, 2, 3, 4. Den genetiske variation af celler i en population er en mekanisme for denne sort af responser, men der er også flere ikke-genetiske faktorer, der kan øge variabiliteten af responser selv i en klonal population af celler. For eksempel kan niveauerne af individuelle proteiner og andre vigtige signalmolekyler variere på en celle til celle-basis, hvilket giver anledning til variation i downstream genekspressionsprofiler. Derudover kan genaktivering forekomme i kortvarige byger af udskrifter 5, 6, der kan være begrænset til et relativt lille antal udskrifter pr burst 7, 8, 9. Sådanstokastik i genaktivering kan i høj grad bidrage til variation i biologiske reaktioner og kan give en selektiv fordel i mikroorganismer 10 og i pattedyrsceller 1, 2 reagerer på en fysiologisk stimulus. På grund af både genetiske og ikke-genetiske kilder til variation kan genekspressionsprofilen af enhver given celle som reaktion på en stimulus er meget forskellig fra den gennemsnitlige genekspression profil opnået fra målingen af bulk respons. Fastsættelse af, i hvilken udstrækning de enkelte celler viser variation i respons på en stimulus kræver teknikker til isolering af individuelle celler, måling af ekspressionsniveauerne for transkripter af interesse, og den beregningsmæssige analyse af de resulterende udtryk data.
Der er flere tilgange til analyse af genekspression i enkelte celler, der dækker en bred vifte af omkostninger, antal udskrifter undersøgt, ognøjagtigheden af kvantificering. For eksempel enkelt-celle-RNA-Seq tilbyder en bred dybde af transkript dækning og evnen til at kvantificere tusindvis af særskilte transkripter til de mest højt udtrykte gener i individuelle celler; dog kan omkostningerne forbundet med en sådan sekventering dybde være uoverkommelige, selv om omkostningerne fortsætte med at falde. Omvendt, single-molekyle RNA fluorescens in situ hybridisering (smRNA FISH) tilbyder præcis kvantificering af udskrifter for selv lave ekspression af gener til en rimelig pris pr gen af interesse; dog kan kun et lille antal af målgener analyseres i en given celle ved denne fremgangsmåde. Kvantitative PCR-baserede analyser, der er beskrevet i denne protokol, giver en mellemvej mellem disse teknikker. Disse assays anvender en mikrofluid realtids-PCR-maskine at kvantificere op til 96 transkripter af interesse på et tidspunkt i op til 96 celler. Mens hver af de førnævnte metoder har fornødne hardware omkostninger, udgifter til en individuel qPCR analysen er forholdsvislav. Denne protokol er tilpasset fra en foreslået af en producent af en mikrofluid real-time PCR-maskine (protokol ADP 41, Fluidigm). For at aktivere estimeringen af det absolutte antal af hver udskrift i en PCR-baseret tilgang, har vi udvidet protokollen at gøre brug af interne kontroller af tilberedte target gen amplikoner, der kan bruges på tværs af flere eksperimenter.
Som et eksempel på denne teknik, er kvantificeringen af ekspressionen af gener reguleret af tumor suppressor p53 i humane MCF-7 brystkarcinomceller beskrevet 11. Cellerne udfordres med et kemisk middel, der inducerer DNA dobbelt-strengbrud. Tidligere undersøgelser har vist, at p53 respons på DNA dobbelt-strengbrud udviser stor heterogenitet i individuelle celler, både med hensyn til p53-niveauer 12 og i aktiveringen af distinkte målgener 11. Endvidere p53 regulerer ekspressionen af over 100velkarakteriseret målgener involveret i adskillige nedstrøms veje, herunder cellecyklusstop, apoptose, og senescens 13, 14. Da p53-medieret respons i hver celle er både kompleks og variabel, analysen af fordelene system fra en tilgang, hvor næsten 100 målgener kan probes samtidig i individuelle celler, såsom den nedenfor beskrevne. Med mindre ændringer (såsom alternative metoder til enkelt-celle isolation og lysis), kan protokollen let tilpasses til at studere en lang række af mammale celletyper, udskrifter og cellulære reaktioner.
Med korrekt forudgående forberedelse, kan gennemføres en runde celle sortering og genekspression måling i henhold til denne protokol over en periode på tre dage. foreslås følgende tidsplan: på forhånd vælge de udskrifter af interesse, identificere og validere primerpar der forstærker cDNA fra dem transcrIPTS, og forberede de standarder og primerblandinger bruger disse primere. På dag 1 efter cellebehandling, høst og sortere celler, udføre revers transkription og specifik målamplifikation, og behandle prøverne med en exonuklease til fjernelse inkorporerede primere. På dag 2, udfører kvalitetskontrol på sorterede celler under anvendelse af qPCR. Endelig på dag 3, måle genekspression i de sorterede celler ved hjælp mikrofluid qPCR. Figur 1 opsummerer de involverede trin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har præsenteret en fremgangsmåde til isolering individuelle pattedyrsceller fra en population af adhærente celler dyrket i kultur og til analyse af ekspressionen af ca. 96 gener i hver celle. God forudgående forberedelse er kritisk for denne metode til at fungere godt. Især design og test primerpar specifikke for udskrifter af interesse (trin 1,2-1,3) er tidskrævende, men vigtige skridt, som primerne bestemme kvaliteten af de encellede målinger. Når pålidelige primerpar er opnået, bliver de brug…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke V. Kapoor i CCR ETIB flowcytometri Core for hendes hjælp i udførelsen cellen sortering under udviklingen af denne protokol. Vi takker også M. Raffeld og CCR LP Molekylær Diagnostik Unit og J. Zhu og NHLBI DNA-sekventering og Genomics Core for deres hjælp i at udføre qPCR under udviklingen af denne protokol. Denne forskning blev støttet af Intramural Program for NIH.
Materials
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0-mL low adhesion microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2-mL Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified (US) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sealing Film, Sterile | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE Healthcare Life Sciences | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analysis software | Fluidigm | ||
| MATLAB software | MathWorks |
Referências
- Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4 (10), e309+ (2006).
- Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
- Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+ (2015).
- Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).
- Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genética. 167 (1), 523-530 (2004).
- Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).
- Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).
- Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).
- Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13 (1), 134 (2012).
- . . PCR Technologies: A Technical Guide. , (2014).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).
- . . Flow Cytometry: Principles and Applications. , (2007).
- . . Real-time PCR. , (2006).
- Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13 (1), 328 (2012).
- Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).
- Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).
- Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77 (2016).
- Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
