Unicellulaire profil d'expression génique utilisant FACS et qPCR avec les normes internes
Summary
We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.
Abstract
Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.
Introduction
Les cellules individuelles dans une population peuvent montrer des réponses très différentes à un stimulus uniforme physiologique 1, 2, 3, 4. La variation génétique des cellules dans une population est un mécanisme pour cette série de réactions, mais il existe également plusieurs facteurs non génétiques qui peuvent augmenter la variabilité des réponses, même dans une population clonale de cellules. Par exemple, les niveaux de différentes protéines et d'autres molécules de signalisation importantes peuvent varier sur une base cellule par cellule, donnant lieu à des variations dans les profils d'expression des gènes en aval. En outre, l' activation du gène peut se produire dans des éclats de courte durée des relevés de notes 5, 6 qui peuvent être limités à un nombre relativement faible de transcrits par rafale 7, 8, 9. Telstochasticité dans l' activation de gène peut grandement contribuer à la variabilité des réponses biologiques et peut fournir un avantage sélectif sur les micro – organismes 10 dans des cellules mammifères et 1, 2 répondant à un stimulus physiologique. En raison de ces deux sources génétiques et non génétiques de la variation, le profil d'expression génique d'une cellule donnée en réponse à un stimulus peut être très différente du profil d'expression génique moyenne obtenue à partir de la mesure de la réponse en vrac. Déterminer la mesure dans laquelle les cellules individuelles présentent une grande variabilité dans la réponse à un stimulus nécessite des techniques pour l'isolement de cellules individuelles, la mesure des niveaux d'expression des transcrits d'intérêt, et l'analyse informatique des données d'expression en résultant.
Il existe plusieurs approches pour le dosage de l'expression des gènes dans des cellules individuelles, couvrant un large éventail de coûts, nombre de transcrits sondé, etprécision de quantification. Par exemple, une seule cellule ARN-Seq offre une grande profondeur de la couverture de la transcription et de la capacité à quantifier des milliers de transcriptions distinctes pour les gènes les plus fortement exprimé dans des cellules individuelles; Cependant, le coût associé à une telle profondeur de séquençage peut être prohibitif, même si les coûts continuent de diminuer. A l' inverse, une seule molécule d' ARN hybridation fluorescente in situ (smRNA FISH) propose une quantification précise des transcriptions pour encore faible expression de gènes à un coût raisonnable par gène d'intérêt; Cependant, seul un petit nombre de gènes cibles peut être testée dans une cellule donnée par cette approche. tests basés sur la PCR quantitative, décrits dans le présent protocole, fournissent un juste milieu entre ces techniques. Ces tests utilisent une machine microfluidique PCR en temps réel pour quantifier jusqu'à 96 transcriptions d'intérêt à un moment dans un maximum de 96 cellules. Bien que chacune des méthodes mentionnées ci-dessus a des coûts matériels nécessaires, le coût de tout essai qPCR individuelle est relativementfaible. Ce protocole est adapté de celui suggéré par le fabricant d'une machine microfluidique PCR en temps réel (Protocole ADP 41, Fluidigm). Pour permettre l'estimation du nombre absolu de chaque transcription dans une approche basée sur la PCR, nous avons élargi le protocole à utiliser des contrôles internes de préparées amplicons de gènes cibles qui peuvent être utilisés dans de multiples expériences.
A titre d'exemple de cette technique, la quantification de l'expression des gènes régulés par le suppresseur de tumeur p53 dans les cellules MCF-7 de carcinome du sein humain 11 est décrit. Les cellules sont contestées avec un agent chimique qui induit ADN cassures double brin. Des études antérieures ont montré que la réponse de p53 à l' ADN cassures double brin présente une grande hétérogénéité dans des cellules individuelles, tant en termes de niveaux de p53 12 et dans l'activation de gènes cibles distinctes 11. En outre, p53 régule l'expression de plus de 100bien caractérisé des gènes cibles impliqués dans de nombreuses voies en aval, y compris l' arrêt du cycle cellulaire, l' apoptose et la sénescence 13, 14. Puisque la réponse médiée par p53 dans chaque cellule est à la fois complexe et variable, l'analyse des avantages du système à partir d'une approche dans laquelle près de 100 gènes cibles peut être sondé simultanément dans des cellules individuelles, telles que celles décrites ci-dessous. Avec de légères modifications (telles que les méthodes alternatives pour l'isolement de cellules isolées et une lyse), le protocole peut être facilement adapté pour étudier un large éventail de types de cellules de mammifère, des transcriptions et des réponses cellulaires.
Avec une préparation préalable appropriée, une ronde de tri cellulaire et la mesure de l'expression du gène peut être réalisée selon ce protocole sur une période de trois jours. Le calendrier suivant est proposé: à l'avance, sélectionner les transcriptions d'intérêt, d'identifier et de valider les paires d'amorces qui amplifient l'ADNc de ceux transcrIPTS, et de préparer les normes et mélanges d'amorces en utilisant ces amorces. Le jour 1, après un traitement cellulaire, la récolte et de trier les cellules, effectuer la transcription inverse et l'amplification de cible spécifique, et de traiter les échantillons avec une exonucléase pour éliminer les amorces non constituées en société. Le jour 2, effectuer un contrôle de qualité sur les cellules triées en utilisant qPCR. Enfin, le jour 3, mesurer l'expression des gènes dans les cellules triées en utilisant microfluidique qPCR. La figure 1 résume les différentes étapes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons présenté un procédé pour isoler des cellules de mammifères individuels à partir d'une population de cellules adhérentes cultivées en culture et pour le dosage de l'expression d'environ 96 gènes dans chaque cellule. Une bonne préparation préalable est essentielle pour que cette méthode fonctionne bien. En particulier, la conception et les tests paires d'amorces spécifiques pour les transcriptions d'intérêt (étapes 1,2-1,3) prennent du temps, mais d'importantes étapes, c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier V. Kapoor dans le CCR ETIB cytométrie de flux de base pour son aide dans l'exécution du tri cellulaire au cours du développement de ce protocole. Nous remercions également M. l'Unité CCR LP Molecular Diagnostics Raffeld et et J. Zhu et le NHLBI séquençage de l'ADN et la génomique de base pour leur aide dans l'exécution de la qPCR lors de l'élaboration de ce protocole. Cette recherche a été soutenue par le programme intra-muros des NIH.
Materials
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0-mL low adhesion microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2-mL Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified (US) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sealing Film, Sterile | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE Healthcare Life Sciences | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analysis software | Fluidigm | ||
| MATLAB software | MathWorks |
Referências
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