Einzellige Genexpressionsprofile mittels FACS und qPCR mit internen Standards
Summary
We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.
Abstract
Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.
Introduction
Einzelne Zellen in einer Population kann zu einem einheitlichen physiologischen Reiz 1, 2, 3, 4 sehr unterschiedliche Reaktionen zeigen. Die genetische Veränderung der Zellen in einer Population eines Mechanismus für diese Vielzahl von Antworten, aber es gibt auch einige nicht-genetischen Faktoren, die die Variabilität von Antworten erhöhen können, selbst in einer klonalen Population von Zellen. Zum Beispiel können die Ebenen der einzelnen Proteine und andere wichtige Signalmoleküle variieren auf einer Zelle-für-Zelle-Basis, was zu geben Variation in nachgeschalteten Genexpressionsprofilen. Zusätzlich können kurzzeitige Bursts von Transkripten 5 treten Genaktivierung in 6, der 7 auf eine relativ kleine Anzahl von Transkripten pro Burst begrenzt sein kann, 8, 9. Eine solchestochasticity in Genaktivierung kann stark von Schwankungen der biologischen Reaktionen beitragen und einen selektiven Vorteil in Mikroorganismen 10 und in Säugetierzellen 1, 2 reagiert auf einen physiologischen Reiz bieten kann. Aufgrund beiden genetischen und nicht-genetischen Variationsquellen kann das Genexpressionsprofil eines beliebigen gegebenen Zelle in Reaktion auf einen Reiz deutlich vom Durchschnitt Genexpressionsprofil unterscheiden sich von der Messung der Massenantwort erhalten. Das Ausmaß, in dem einzelne Zellen Variabilität in Reaktion auf einen Reiz zeigen, erfordert Techniken zur Isolierung von einzelnen Zellen, die Messung der Expressionsspiegel für Transkripte von Interesse, und die Computeranalyse der resultierenden Expressionsdaten.
Es gibt mehrere Ansätze zur Untersuchung der Genexpression in einzelnen Zellen, eine breite Palette von Kosten abdeckt, die Anzahl der Transkripte sondiert, undGenauigkeit der Quantifizierung. So bietet zum Beispiel Single-Cell-RNA-Seq eine große Tiefe transcript Abdeckung und der Möglichkeit, Tausende von verschiedenen Transkripte für den am höchsten exprimierten Gene in einzelnen Zellen zu quantifizieren; jedoch verbunden sind die Kosten, die mit solchen Sequenzierungstiefe kann unerschwinglich sein, auch wenn die Kosten weiter sinken. Im Gegensatz dazu bietet Einzelmolekül RNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH smRNA) genaue Quantifizierung von Transkripten für sogar Low-Expression von Genen zu vernünftigen Kosten pro Gen von Interesse; jedoch nur eine geringe Anzahl von Zielgenen können durch diese Vorgehensweise in einer gegebenen Zelle untersucht werden. Quantitative PCR-basierten Assays, in diesem Protokoll beschrieben, einen Mittelweg zwischen diesen Techniken bereitzustellen. Diese Assays verwenden eine mikrofluidische Echtzeit-PCR-Maschine zu einem Zeitpunkt, zu 96 Transkripte von Interesse zu quantifizieren bis in bis zu 96 Zellen. Während jedes der vorgenannten Verfahren erforderliche Hardwarekosten hat, sind die Kosten eines einzelnen qPCR Assay relativniedrig. Dieses Protokoll wird von einem durch den Hersteller eines mikrofluidischen Echtzeit-PCR-Maschine (Protokoll ADP 41, Fluidigm) vorgeschlagen angepasst. Um die Abschätzung der absoluten Nummer jedes Transkript in einem PCR-basierten Ansatz zu ermöglichen, haben wir das Protokoll erweitert, um die Verwendung von internen Kontrollen vorbereiteter Zielgen Amplikons machen, die über mehrere Experimente verwendet werden kann.
Als ein Beispiel für diese Technik ist 11 beschrieben die Quantifizierung der Expression von Genen durch den Tumorsuppressor p53 in menschlichen MCF-7 – Brustkarzinomzellen reguliert. Die Zellen werden mit einem chemischen Mittel in Frage gestellt, die DNA-Doppelstrangbrüche induziert. Frühere Studien haben gezeigt , dass die p53 – Antwort auf DNA – Doppelstrangbrüchen eine große Heterogenität in einzelnen Zellen aufweist, sowohl in Bezug auf p53 Ebenen 12 und bei der Aktivierung verschiedener Zielgene 11. Darüber hinaus reguliert p53 die Expression von mehr als 100gut charakterisierten Zielgene in zahlreichen Downstream Wegen beteiligt, einschließlich Zellzyklusarrest, Apoptose und Seneszenz 13, 14. Da die p53-vermittelte Reaktion in jeder Zelle sowohl komplex und variabel ist, kann die Analyse des Systems profitiert von einem Ansatz, bei dem nahezu 100 Zielgene gleichzeitig in einzelnen Zellen werden untersucht, wie das unten beschrieben wird. Mit leichten Modifikationen (wie alternative Verfahren zur Einzelzellisolierung und Lyse), kann das Protokoll leicht ein breites Spektrum von Säugerzelltypen, Protokolle und zelluläre Antworten zu untersuchen angepasst werden.
Mit der richtigen rechtzeitige Vorbereitung kann eine Runde der Zellsortierung und Genexpressionsmessung durchgeführt werden, gemäß diesem Protokoll über einen Zeitraum von drei Tagen. Das folgende Zeit wird vorgeschlagen: im Voraus, die Transkripte von Interesse auswählen, zu identifizieren und die Primerpaare zu validieren, die die cDNA von jenen transcr verstärkenIPTS und bereite die Standards und Zündmittelmischungen diese Primer verwendet. Am Tag 1 nach Zellbehandlung, Ernte und sortieren Sie die Zellen, führen die reverse Transkription und spezifische Ziel-Amplifikation und Behandlung der Proben mit einer Exonuklease unincorporated Primer zu entfernen. Am Tag 2, führen an der sortierten Zellen Qualitätskontrolle mit qPCR. Schließlich, am Tag 3, messen die Genexpression in den sortierten Zellen mikrofluidischen qPCR verwendet wird. In Abbildung 1 sind die Schritte beteiligt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben zur Isolierung von einzelnen Säugerzellen aus einer Population von anhaftenden Zellen in der Kultur und zur Untersuchung der Expression von etwa 96 Gene in jeder Zelle gezüchtet ein Verfahren dargestellt. Gute rechtzeitige Vorbereitung ist entscheidend für diese Methode gut zu funktionieren. Insbesondere Entwerfen und Testen Primerpaare spezifisch für die Transkripte von Interesse (Schritte 1,2-1,3) sind zeitaufwendig, aber wichtige Schritte, wie die Primer, die Qualität der Einzelzellmessungen bestimmen….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten, dass bei der Durchführung der Zellsortierung bei der Entwicklung dieses Protokolls V. Kapoor in der CCR ETIB Flow Cytometry Kern für ihre Hilfe zu danken. Wir danken auch M. Raffeld und die CCR LP Molecular Diagnostics Unit und J. Zhu und die NHLBI DNA-Sequenzierung und Genomics Core-für ihre Hilfe in der qPCR bei der Entwicklung dieses Protokolls durchgeführt wird. Diese Forschung wurde von der Intramural Programm des NIH unterstützt.
Materials
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0-mL low adhesion microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2-mL Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified (US) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sealing Film, Sterile | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE Healthcare Life Sciences | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analysis software | Fluidigm | ||
| MATLAB software | MathWorks |
Referências
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