Encellede Gene Expression Profilering hjelp FACS og qPCR med interne standarder
Summary
We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.
Abstract
Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.
Introduction
Individuelle celler i en populasjon kan vise vidt forskjellige responser til en ensartet fysiologisk stimulans en, to, tre, fire. Den genetiske variasjon av celler i en populasjon er en mekanisme for denne rekke reaksjoner, men det finnes også flere ikke-genetiske faktorer som kan øke variasjonen av responser, selv i en klonal populasjon av celler. For eksempel kan nivåene av individuelle proteiner og andre viktige signalmolekyler variere på en celle-for-celle-basis, noe som gir opphav til variasjon i nedstrøms genekspresjonsprofiler. I tillegg kan genaktivering forekomme i kortvarige utbrudd av transkripter 5, 6 som kan være begrenset til et relativt lite antall transkripter pr burst 7, 8, 9. Slikstochasticity i genaktivering i stor grad kan bidra til variasjon i biologiske reaksjoner, og kan gi en selektiv fordel i mikroorganismer 10 og i pattedyrceller 1, 2 svarer på en fysiologisk stimulans. På grunn av både genetiske og ikke-genetiske kilder for variasjon, kan genekspresjonen profilen til en gitt celle som respons på en stimulus være svært forskjellig fra den gjennomsnittlige genekspresjon profilen oppnådd fra målingen av masseresponsen. Å bestemme i hvilken grad de enkelte cellene vise forskjell i respons på en stimulus krever teknikker for isolering av individuelle celler, er målingen av uttrykket nivåer for transkripter av interesse, og den matematisk analyse av de resulterende data uttrykk.
Det er flere tilnærminger for analysering av genekspresjon i enkeltceller, som dekker et bredt spekter av kostnader, antall transkripter undersøkt, ognøyaktigheten av kvantifisering. For eksempel, enkelt-celle RNA-Seq tilbyr et bredt dybde av transkripsjon dekning og evnen til å kvantifisere tusener av distinkte transkripter for de høyt uttrykte gener i individuelle celler; imidlertid, kan kostnadene forbundet med slik sekvensering dybde være prohibitive, selv om kostnadene fortsetter å avta. Omvendt, single-molekyl RNA fluorescens in situ hybridisering (smRNA FISH) gir presis kvantifisering av transkripsjoner for selv lave uttrykke genene til en rimelig pris per genet av interesse; kan imidlertid bare et lite antall av målgener bli analysert i en gitt celle ved denne tilnærming. Kvantitative PCR-baserte analyser, som beskrevet i denne protokollen, gir en mellomting mellom disse teknikkene. Disse analysene ansette en microfluidic real-time PCR maskin for å kvantifisere opptil 96 transkripsjoner av interesse om gangen i inntil 96 celler. Selv om hver av de forannevnte fremgangsmåter har de nødvendige maskinvarekostnader, er kostnaden for en hvilken som helst individuell qPCR-analyse relativtlav. Denne protokollen er tilpasset fra en foreslått av en produsent av en mikrofluid real-time PCR maskin (Protocol ADP 41, Fluidigm). For å aktivere estimering av det absolutte antall av hver transkripsjon i en PCR-basert tilnærming, har vi utvidet protokollen til å gjøre bruk av interne kontroller preparerte target gen amplikonene som kan brukes på tvers av flere eksperimenter.
Som et eksempel på denne teknikk blir kvantifisering av ekspresjonen av gener regulert av p53 tumor suppressor i MCF-7 humane brystcancer-celler som er beskrevet 11. Cellene blir utfordret med et kjemisk middel som induserer DNA dobbelttrådbrudd. Tidligere studier har vist at p53 svar på DNA-dobbelttrådbrudd viser stor heterogenitet i enkeltceller, både i form av p53 nivåer 12 og i aktivering av forskjellige målgener 11. Videre regulerer p53 ekspresjonen av over 100godt karakterisert målgener involvert i en rekke nedstrøms veier, inkludert cellesyklus arrest, apoptose, og senescence 13, 14. Siden p53-mediert respons i hver celle er både komplisert og variabel, analyse av systemet drar nytte av en tilnærming der nesten 100 målgener kan bli analysert samtidig i individuelle celler, slik som den som er beskrevet nedenfor. Med små modifikasjoner (slik som alternative fremgangsmåter for enkeltcelleisolasjon og lyse) kan protokollen lett tilpasses for å studere et bredt utvalg av pattedyrcelletyper, transkripter, og cellulære responser.
Med riktig forhånd forberedelser, kan en runde med celle sortering og genekspresjon måling utføres i henhold til denne protokoll over en periode på tre dager. Følgende timing er foreslått: på forhånd, velger transkripsjoner av interesse, identifisere og validere primer parene som forsterker cDNA fra de transcrIPTS, og forberede de standarder og primerblandinger bruker disse primere. På dag 1 etter cellen behandling, høsting og sorterer cellene, utføre revers transkripsjon og bestemt mål forsterkning, og behandle prøvene med en eksonuklease for å fjerne kommunefritt primere. På dag to, kvalitetssikre sortert celler ved hjelp av qPCR. Til slutt, på dag tre, måle genuttrykk i de sorterte celler ved hjelp microfluidic qPCR. Figur 1 oppsummerer de trinnene som er involvert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har presentert en metode for isolering av de enkelte pattedyrceller fra en populasjon av adherente celler dyrket i kultur, og for analysering av ekspresjon av ca. 96 gener i hver celle. God forhånd forberedelser er avgjørende for denne metoden til å fungere godt. Spesielt design og testing primerpar spesifikke transkripsjoner av interesse (trinn 1,2-1,3) er tidkrevende, men viktige skritt, som primere bestemme kvaliteten på encellede målinger. Når pålitelige primerpar er oppnådd, blir de brukt til å forsterk…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke V. Kapoor i CCR ETIB flowcytometrisystemer Kjerne for hennes hjelp i å utføre cellesortering under utviklingen av denne protokollen. Vi takker også M. Raffeld og CCR LP Molecular Diagnostics Unit og J. Zhu og NHLBI DNA sekvensering og genomKjerne for deres hjelp i å utføre qPCR under utviklingen av denne protokollen. Denne forskningen ble støttet av egenutført Program for NIH.
Materials
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0-mL low adhesion microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2-mL Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified (US) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sealing Film, Sterile | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE Healthcare Life Sciences | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analysis software | Fluidigm | ||
| MATLAB software | MathWorks |
Referências
- Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4 (10), e309+ (2006).
- Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
- Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+ (2015).
- Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).
- Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genética. 167 (1), 523-530 (2004).
- Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).
- Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).
- Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).
- Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13 (1), 134 (2012).
- . . PCR Technologies: A Technical Guide. , (2014).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).
- . . Flow Cytometry: Principles and Applications. , (2007).
- . . Real-time PCR. , (2006).
- Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13 (1), 328 (2012).
- Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).
- Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).
- Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77 (2016).
- Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
