Perfil de expressão gênica de célula única usando FACS e qPCR com controles internos
Summary
We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.
Abstract
Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.
Introduction
As células individuais em uma população pode mostrar respostas muito diferentes a um estímulo uniforme fisiológico 1, 2, 3, 4. A variação genética de células numa população é um mecanismo para essa variedade de respostas, mas também existem vários factores não genéticos que podem aumentar a variabilidade das respostas, mesmo numa população clonal de células. Por exemplo, os níveis de proteínas individuais e outras moléculas de sinalização importantes pode variar numa base de célula-por-célula, dando origem a variações nos perfis de expressão de gene a jusante. Além disso, a activação do gene pode ocorrer em rajadas de curta duração de transcritos de 5, 6, que pode ser limitada a um número relativamente pequeno de transcritos por explosão 7, 8, 9. Talestocasticidade em activação do gene pode contribuir grandemente para a variabilidade na resposta biológica e pode proporcionar uma vantagem selectiva em microorganismos e 10 em células de mamífero 1, 2 respondendo a um estímulo fisiológico. Devido às duas fontes genéticos e não genéticos de variação, o perfil de qualquer célula em resposta a um estímulo a expressão do gene pode ser muito diferente da média do perfil de expressão do gene obtido a partir da medição da resposta grandes quantidades. Determinação da extensão à qual as células individuais mostram a variabilidade em resposta a um estímulo requer técnicas para o isolamento de células individuais, a medição dos níveis de expressão de transcritos de interesse, e a análise computacional de dados de expressão resultantes.
Existem várias abordagens para ensaiar a expressão do gene em células individuais, que cobrem uma vasta gama de custos, número de transcritos sondado, eprecisão da quantificação. Por exemplo, uma única célula de RNA-Seq oferece uma grande profundidade de cobertura de transcrição e a capacidade de quantificar milhares de transcritos distintos para os genes mais altamente expresso em células individuais; No entanto, o custo associado com tal profundidade de sequenciação pode ser proibitivo, embora os custos de continuar a diminuir. Por outro lado, uma única molécula de RNA hibridização fluorescente in situ (FISH smRNA) oferece uma quantificação precisa de transcrições, mesmo para baixo expressar genes a um custo razoável por gene de interesse; No entanto, apenas um pequeno número de genes alvo podem ser ensaiados numa dada célula por esta abordagem. Quantitativas ensaios baseados em PCR, descritos neste protocolo, fornecer um meio termo entre essas técnicas. Estes ensaios empregam um real-time PCR máquina microfluídico para quantificar até 96 transcrições de interesse em um momento em até 96 células. Enquanto cada um dos métodos acima mencionados tem custos de hardware requeridas, o custo de qualquer ensaio qPCR indivíduo é relativamentebaixo. Este protocolo é adaptado de um sugerido pelo fabricante de um real-time PCR máquina microfluídico (Protocolo ADP 41, Fluidigm). Para habilitar a estimativa do número absoluto de cada transcrito em uma abordagem baseada em PCR, nós expandimos o protocolo para fazer uso dos controles internos de amplicons do gene alvo preparados que podem ser usados em vários experimentos.
Como um exemplo desta técnica, a quantificação da expressão de genes regulados por o supressor de tumor p53 em células MCF-7 de carcinoma da mama humano está descrito 11. As células são desafiadas com um agente químico que induz quebras de ADN de cadeia dupla. Estudos anteriores demonstraram que a resposta da p53 a ADN quebras de cadeia dupla apresenta uma grande quantidade de heterogeneidade em células individuais, quer em termos de níveis de p53 e 12 na activação de genes alvo distintas 11. Além disso, a p53 regula a expressão de mais de 100bem caracterizado genes alvo envolvidas em numerosas vias a jusante, incluindo a paragem do ciclo celular, a apoptose, senescência e 13, 14. Uma vez que a resposta mediada por p53 em cada célula é complexa e variável, a análise dos benefícios do sistema a partir de uma abordagem em que cerca de 100 genes alvo podem ser sondados simultaneamente em células individuais, tais como os descritos abaixo. Com ligeiras modificações (tais como métodos alternativos para o isolamento de uma única célula e de lise), o protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar uma ampla gama de tipos de células de mamíferos, transcrições e respostas celulares.
Com preparação prévia adequada, uma rodada de separação de células e medição expressão do gene pode ser realizada de acordo com este protocolo durante um período de três dias. O seguinte calendário é sugerido: com antecedência, selecione as transcrições de interesse, identificar e validar os pares de primers que amplificam o cDNA daqueles transcrIPTS, e preparar as normas e misturas de iniciadores que utilizam esses iniciadores. No dia 1, após o tratamento de células, e colheita classificar as células, realizar a transcrição reversa e a amplificação do alvo específico, e tratar as amostras com uma exonuclease para remover os iniciadores não incorporados. No dia 2, realizar o controle de qualidade sobre células classificadas usando qPCR. Finalmente, no dia 3, medir a expressão genética nas células classificadas usando microfluídico qPCR. A Figura 1 resume as etapas envolvidas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós apresentamos um método para o isolamento de células de mamíferos individuais a partir de uma população de células aderentes cultivadas em cultura e para ensaiar a expressão de genes de aproximadamente 96 em cada célula. Bom preparação prévia é crítico para este método funcione bem. Em particular, concepção e teste de iniciadores específicos para os pares de transcritos de interesse (passos 1,2-1,3) são demorados passos importantes, mas, como os iniciadores de determinar a qualidade das medições …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nós gostaríamos de agradecer a V. Kapoor na CCR ETIB Citometria de Fluxo do núcleo para sua ajuda na realização da separação de células durante o desenvolvimento deste protocolo. Agradecemos também a M. Raffeld ea Unidade de CCR LP Diagnóstico Molecular e J. Zhu eo NHLBI DNA Sequencing and Genomics núcleo por sua ajuda na realização do qPCR durante o desenvolvimento deste protocolo. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Intramural do NIH.
Materials
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0-mL low adhesion microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2-mL Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified (US) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sealing Film, Sterile | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE Healthcare Life Sciences | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analysis software | Fluidigm | ||
| MATLAB software | MathWorks |
Referências
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