Una sola célula de perfiles de expresión génica El uso de FACS y qPCR con las Normas Internas
Summary
We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.
Abstract
Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.
Introduction
Las células individuales en una población pueden mostrar respuestas muy diferentes a un estímulo fisiológico uniforme 1, 2, 3, 4. La variación genética de las células en una población es un mecanismo para esta variedad de respuestas, pero también hay varios factores no genéticos que pueden aumentar la variabilidad de respuestas, incluso en una población clonal de células. Por ejemplo, los niveles de proteínas individuales y otras moléculas de señalización importantes pueden variar sobre una base de celda por celda, dando lugar a la variación en los perfiles de expresión de genes aguas abajo. Además, la activación de genes puede ocurrir en ráfagas de corta duración de las transcripciones de 5, 6 que puede estar limitado a un número relativamente pequeño de las transcripciones por ráfaga 7, 8, 9. Talestocasticidad en la activación de genes puede contribuir en gran medida a la variabilidad en las respuestas biológicas y puede proporcionar una ventaja selectiva en los microorganismos 10 y en células de mamíferos 1, 2 de responder a un estímulo fisiológico. Debido a ambas fuentes genéticos y no genéticos de variación, el perfil de expresión génica de cualquier célula dada en respuesta a un estímulo puede diferir en gran medida de perfil de expresión génica medio obtenido de la medición de la respuesta a granel. La determinación de la medida en la que las células individuales muestran variabilidad en la respuesta a un estímulo requiere de técnicas para el aislamiento de células individuales, la medición de los niveles de expresión de los transcritos de interés, y el análisis computacional de los datos de expresión resultantes.
Existen varios enfoques para ensayar la expresión génica en células individuales, que cubren una amplia gama de costos, número de transcripciones sondeó, yexactitud de la cuantificación. Por ejemplo, una sola célula RNA-Seq ofrece una amplia profundidad de la cobertura transcripción y la capacidad de cuantificar miles de distintas transcripciones de los genes más altamente expresado en las células individuales; sin embargo, el costo asociado con tal profundidad de secuenciación puede ser prohibitivo, aunque los costos continúan disminuyendo. Por el contrario, una sola molécula de ARN hibridación in situ fluorescente (FISH smRNA) ofrece una cuantificación precisa de las transcripciones para incluso bajo la expresión de genes a un costo razonable por gen de interés; sin embargo, sólo un pequeño número de genes diana puede ensayarse en una célula dada por este enfoque. ensayos basados en PCR cuantitativa, que se describe en este protocolo, proporcionan un término medio entre estas técnicas. Estos ensayos emplean una máquina de PCR en tiempo real de microfluidos para cuantificar hasta 96 transcripciones de interés en un momento en hasta 96 células. Si bien cada uno de los métodos antes mencionados tiene los costos de hardware necesarios, el costo de cualquier ensayo qPCR individuo es relativamentebajo. Este protocolo es una adaptación de uno sugerido por el fabricante de una máquina de PCR en tiempo real de microfluidos (Protocolo de ADP 41, Fluidigm). Para habilitar la estimación del número absoluto de cada una transcripción en un enfoque basado en la PCR, hemos ampliado el protocolo para hacer uso de los controles internos de los amplicones del gen diana preparados que se pueden utilizar a través de múltiples experimentos.
Como ejemplo de esta técnica, la cuantificación de la expresión de genes regulados por la p53 supresor de tumores en células MCF-7 de carcinoma de mama humano se describe 11. Las células se expusieron a un agente químico que induce ADN de doble filamento se rompe. Estudios anteriores han demostrado que la respuesta de p53 al ADN doble filamento se rompe exhibe una gran cantidad de heterogeneidad en las células individuales, tanto en términos de los niveles de p53 12 y en la activación de genes diana distintas 11. Además, p53 regula la expresión de más de 100bien caracterizado los genes diana implicados en numerosas vías aguas abajo, incluyendo la detención del ciclo celular, la apoptosis, la senescencia y 13, 14. Puesto que la respuesta mediada por p53 en cada celda es complejo y variable, el análisis de los beneficios del sistema a partir de un enfoque en el que cerca de 100 genes diana se puede probar de forma simultánea en las células individuales, como la que se describe a continuación. Con ligeras modificaciones (tales como métodos alternativos para el aislamiento de células individuales y la lisis), el protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar una amplia gama de tipos de células de mamíferos, transcripciones, y las respuestas celulares.
Con una preparación previa adecuada, una ronda de clasificación de células y medida de la expresión génica puede llevarse a cabo de acuerdo con este protocolo en un período de tres días. El siguiente calendario se sugiere: por adelantado, seleccionar las transcripciones de interés, identificar y validar los pares de cebadores que amplifican el ADNc a partir de los transcrIPTS, y preparar las normas y las mezclas de iniciadores que utilizan estos cebadores. En el Día 1, después del tratamiento de células, la cosecha y ordenar las células, lleve a cabo la transcripción inversa y la amplificación de la diana específica y el tratamiento de las muestras con una exonucleasa para eliminar los cebadores no incorporados. En el día 2, lleve a cabo el control de calidad en células clasificadas utilizando qPCR. Por último, el día 3, medir la expresión génica en las células clasificadas utilizando microfluidos qPCR. La Figura 1 resume los pasos involucrados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos presentado un método para aislar células de mamíferos individuales de una población de células adherentes cultivadas en cultivo y para someter a ensayo la expresión de aproximadamente 96 genes en cada célula. Buena preparación previa es fundamental para que este método funcione bien. En particular, el diseño y las pruebas de imprimación pares específicos de las transcripciones de interés (pasos 1.2-1.3) son mucho tiempo, pero importantes pasos, como los cebadores determinan la calidad de las medicione…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a V. Kapoor en el CCR ETIB Citometría de Flujo Core por su ayuda en la realización de la clasificación de células durante el desarrollo de este protocolo. Agradecemos también a la Unidad de Diagnóstico Molecular CCR LP M. y J. Raffeld y Zhu y el NHLBI ADN Secuenciación y Genómica por su ayuda en la realización de la qPCR durante el desarrollo de este protocolo. Esta investigación fue apoyada por el Programa Intramural del NIH.
Materials
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0-mL low adhesion microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2-mL Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified (US) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sealing Film, Sterile | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE Healthcare Life Sciences | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analysis software | Fluidigm | ||
| MATLAB software | MathWorks |
Referências
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