3D Magnetic Stem Cell Aggregation и биореактор Созревание для регенерации хряща
Summary
Хондрогенез из стволовых клеток требует тонкой настройки условия культивирования. Здесь мы представляем магнитный подход для конденсации клеток, существенный шаг для инициирования хондрогенеза. Кроме того, мы покажем, что динамическое Созревание в биореакторе применяется механическое раздражение на клеточные конструкции и повышает хрящевой внеклеточный матрикс.
Abstract
Хрящ инжиниринг остается проблемой из – за трудности в создании функционального имплантат в пробирке , похожий на нативную ткань. Подход недавно исследовали для развития аутологичных замены предполагает дифференциацию стволовых клеток в хондроциты. Для того, чтобы инициировать этот хондрогенез, степень уплотнения стволовых клеток требуется; Таким образом, мы показали возможность магнитно-конденсационные клеток, как в толстых подмостях и строительных лесов, свободные, с использованием миниатюрных источников магнитного поля в виде клеточных аттракторов. Этот магнитный подход был также использован для руководства совокупного слияния и построить помост свободного, организованный, трехмерный (3D) ткани на несколько миллиметров в размере. В дополнении к наличию усовершенствованного размера, ткань, образованная магнитным приводу слияния представлена значительному увеличение экспрессии коллагена II, и подобная тенденция наблюдались для аггрекан экспрессии. Как родной хрящ был подвергнут сил тшлю повлиял на его структуру 3D, динамическое созревание также было проведено. Биореактор, который обеспечивает механические раздражители использовали для культуры магнитно высевают каркасы в течение периода в 21 дней. Биореактор созревание в значительной степени улучшен хондрогенезе в cellularized строительных лесов; внеклеточный матрикс, полученный в этих условиях был богат коллагеном II и аггреканен. Эта работа описывает инновационный потенциал магнитного конденсации меченых стволовых клеток и динамического созревания в биореакторе для улучшения хондрогенной дифференциации, как строительные леса, свободных и внутри полисахаридные строительных лесов.
Introduction
Магнитные наночастицы уже используются в клинике в качестве контрастных агентов для магнитно-резонансной томографии (МРТ), и их терапевтическое применение продолжать расширяться. Например, недавно было показано , что меченые клетки можно манипулировать в естественных условиях с помощью внешнего магнитного поля и может быть направлен и / или поддерживать на определенном месте имплантации 1, 2, 3. В регенеративной медицине, они могут быть использованы для конструирования тканей , организованных в пробирке 4, в том числе сосудистой ткани 5, 6, 7, 8, кости и хряща 9.
Суставной хрящ погружает в аваскулярной среде, что делает ремонт внеклеточных компонентов матрицы очень ограниченный при возникновении повреждений. По этой причине, researcч в настоящее время сосредоточена на проектировании гиалиновых хрящевых замен, которые могут быть имплантированы в месте дефекта. Для того , чтобы произвести замену аутологичной, некоторые исследовательские группы изучают использование аутологичных хондроцитов в качестве источника клеток 10, 11, в то время как другие подчеркивают способность мезенхимальных стволовых клеток (МСК) дифференцироваться в хондроциты 12, 13. В предыдущих исследованиях здесь воспроизводятся, мы выбрали MSC, так как их отбор проб костного мозга достаточно прост и не требует принесения в жертву здоровых хондроцитов, которые рискуют потерять свой фенотип 14.
Одним из первых шагов необходимо инициировать хондрогенную дифференцировку стволовых клеток являются их конденсацией. Клеточные агрегаты , как правило , формируются с использованием либо центрифугирования или Micromass культуры 15; Однако, эти методы конденсации neitheг представить потенциал, чтобы создать кластеры клеток в пределах толстых лесов, ни потенциала, чтобы контролировать слияние агрегатов. В этой статье мы описываем новаторский подход к конденсации стволовых клеток с использованием MSC магнитной маркировки и магнитного притяжения. Эта техника была доказана , чтобы сформировать строительные леса , свободные 3D конструкций через слияние агрегатов друга с другом , чтобы получить миллиметровый масштаб хрящевой ткани 9. Магнитный высев и толстых больших лесов также позволил возможность увеличения размера сконструированной ткани, проектируя форму с большей готовностью полезной для имплантации, а также диверсификации потенциала для клинического применения в восстановлении хрящей. Здесь мы подробно протокол для магнитного высева MSC в пористые каркасы , состоящих из природных полисахаридов, пуллулана, и декстраны, каркасы , которые ранее использовались для удержания стволовых клеток 16, 17. Хондрогенная дифференцировка finallу проводил в биореакторе, чтобы обеспечить непрерывные питательные вещества и диффузию газа в матрице сердцевину каркасов, посеянных с высокой плотностью клеток. Помимо обеспечения питательных веществ, хондрогенные факторов роста и газа к клеткам, биореактор предложил механическую стимуляцию. В целом, магнитная технология, используемая для удержания стволовых клеток, в сочетании с динамическим созреванием в биореакторе, может заметно улучшить хондрогенную дифференциацию.
Protocol
Representative Results
Discussion
Во-первых, потому что методы, представленные здесь, основаны на интернализации магнитных наночастиц, один важный вопрос, является результатом наночастиц, когда они локализуются в клетках. Это верно , что наночастицы железа могут вызвать потенциальную токсичность или нарушенную способ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить QuinXell технологии и CellD, в частности, Лотар Граннманн и Доминик Гозлан за их помощь в биореакторе. Мы благодарим Екатерину Le Visage, который предоставил нам с пуллулановыми / декстранами полисахаридов каркасов. Эта работа была поддержана Европейским Союзом (проект ERC-2014-CoG Матисса 648779) и по AgenceNationalede ла Recherche (ANR), Франция (проект MagStem ANR-11 SVSE5).
Materials
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules ( γ-Fe2O3) | PHENIX – University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD – University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10M NaOH). Porosity: 185-205µm; Thickness: 7mm; Surface area: 1.8cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| TGF-beta 3 protein 10µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer – Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAsin ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3' ; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3' ; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3' ; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
Referências
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat Biotechnol. 32 (8), 804-818 (2014).
- Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
- Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
- Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
- Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418 (2013).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
- Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
- Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones?. Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
- Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
- Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
- Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
- Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).
- Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
- Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
- Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
- Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
- Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
- Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
- Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
- Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
- Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
- Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
- Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
- Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
- Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).
