3D Magnetic Stem Cell Aggregation och Bioreaktor Mognad för brosk Regeneration
Summary
Kondrogenes från stamceller kräver finjustering av odlingsbetingelser. Här presenterar vi en magnetisk metod för kondense celler, för att ett väsentligt steg initiera kondrogenes. Dessutom visar vi att dynamisk mognad i en bioreaktor applicerar mekanisk stimulering till de cellulära konstruktionerna och förbättrar brosk extracellulär matrisproduktion.
Abstract
Brosk engineering fortfarande en utmaning på grund av de svårigheter i att skapa en funktionell implantat in vitro som liknar den naturliga vävnaden. Ett tillvägagångssätt har nyligen undersökt för utvecklingen av autologa ersättare innebär differentieringen av stamceller till kondrocyter. För att initiera denna kondrogenes, en komprimeringsgrad av stamcellema erfordras; följaktligen visade vi genomförbarheten av magnetiskt kondenserande celler, både inom tjocka byggnadsställningar och byggnadsställning fria, med användning av miniatyriserade magnetiska fältkällor som cell attractors. Denna magnetiska tillvägagångssätt användes också för att styra ballast fusion och för att bygga upp byggnadsställning-fri, organiserad, tredimensionell (3D) vävnader flera millimeter i storlek. Förutom att ha en förbättrad storlek, vävnaden bildad av magnetiskt driven fusion presenterade en signifikant ökning i uttrycket av kollagen II, och en liknande trend observerades för aggrekan uttryck. Som det nativa brosket utsattes för krafter thatt påverkade dess 3D-struktur, var dynamisk mognad också utföras. En bioreaktor som ger mekanisk stimuli användes för att odla de magnetiskt sådda ställningar under en 21-dagars period. Bioreaktor mognad i hög grad förbättrad kondrogenes in i de cellularized byggnadsställningar; den extracellulära matrisen som erhållits under dessa betingelser var rikt på kollagen II och aggrekan. Detta arbete beskrivs den innovativa potential magnetisk kondensation av märkta stamceller och dynamisk mognad i en bioreaktor för förbättrad kondrogen differentiering, både ställningsfria och inom polysackarid-ställningar.
Introduction
Magnetiska nanopartiklar används redan i kliniken som kontrastmedel för magnetisk resonansavbildning (MRI), och deras terapeutiska tillämpningar hålla expanderar. Till exempel, har det nyligen visats att märkta celler kan manipuleras in vivo med användning av ett externt magnetfält och kan styras och / eller bibehålls vid en definierad implantationsstället 1, 2, 3. I regenerativ medicin, kan de användas för att konstruera organiserade vävnader in vitro 4, inkluderande vaskulär vävnad 5, 6, 7, ben 8, och brosk 9.
Ledbrosk är nedsänkt i en avaskulär miljö, vilket gör reparationer av de extracellulära matriskomponenter mycket begränsade när skador uppstår. Av denna anledning research är för närvarande inriktad på konstruktion av hyalinbrosk ersättare som kan implanteras vid skadestället. För att framställa ett autologt ersätta, har vissa forskargrupper undersöka användningen av autologa kondrocyter som en cellkälla 10, 11, medan andra betonar förmågan hos mesenkymala stamceller (MSC) för att differentiera till kondrocyter 12, 13. I tidigare studier rekapituleras här, valde vi MSC, eftersom deras benmärgs sampling är ganska enkel och kräver inte att offra friska kondrocyter, som riskerar att förlora sin fenotyp 14.
Ett tidigt steg viktigt att inleda kondrogena differentieringen av stamceller är deras kondens. Cellaggregat är vanligen bildas med användning av antingen centrifugering eller mikromasskultur 15; emellertid dessa kondensationsmetoder neither presentera potential att skapa cellkluster inom tjocka byggnadsställningar eller potentialen att styra fusion av aggregat. I detta dokument beskriver vi en innovativ strategi för kondense stamceller med hjälp av MSC magnetisk märkning och magnetisk attraktion. Denna teknik har visat sig bilda byggnadsställningar fria 3D konstruktioner via fusion av aggregat med varandra för att erhålla en millimeterskala broskvävnad 9. Magnetisk sådd av tjocka och stora ställningar har också tillåtit möjligheten att öka storleken på den manipulerade vävnaden, designa en form lättare användbar för implantation, och diversifiera möjligheterna för kliniska tillämpningar i broskreparation. Här, vi detalj protokollet för den magnetiska sådd av MSC in i porösa ställningar sammansatta av naturliga polysackarider, pullulan och dextran, ställningar tidigare använts för att begränsa stamceller 16, 17. Kondrogen differentiering var Finally fördes i en bioreaktor för att säkerställa kontinuerlig näringsämne och gas diffusion in i matriskärnan av de byggnadsställningar som ympats med en hög täthet av celler. Förutom att ge näring, kondrogena tillväxtfaktorer och gas till cellerna, bioreaktorn erbjuds mekanisk stimulering. Övergripande, den magnetiska teknik som används för att begränsa stamceller, i kombination med dynamisk mognad i en bioreaktor, markant kan förbättra kondrogen differentiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Först, eftersom de tekniker som presenteras här är beroende av internalisering av magnetiska nanopartiklar, är en viktig fråga resultatet av nanopartiklar när de lokalisera i cellerna. Det är sant att järn nanopartiklar kan utlösa potentiell toxicitet eller nedsatt differentiering kapacitet beroende på deras storlek, beläggning, och exponeringstiden 19, 22. Emellertid, har flera studier visat någon effekt på cellulär fysiologi när inkapslade järn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för QuinXell Technologies och CellD, särskilt Lothar Grannemann och Dominique Ghozlan för deras hjälp med bioreaktorn. Vi tackar Catherine Le Visage, som försett oss med pullulan / dextran polysackarid ställningar. Detta arbete stöddes av EU (ERC-2014-Cog projekt Matisse 648.779) och av AgenceNationalede la Recherche (ANR), Frankrike (MagStem projekt ANR-11 SVSE5).
Materials
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules ( γ-Fe2O3) | PHENIX – University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD – University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10M NaOH). Porosity: 185-205µm; Thickness: 7mm; Surface area: 1.8cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| TGF-beta 3 protein 10µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer – Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAsin ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3' ; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3' ; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3' ; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
Referências
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat Biotechnol. 32 (8), 804-818 (2014).
- Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
- Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
- Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
- Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418 (2013).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
- Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
- Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones?. Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
- Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
- Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
- Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
- Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).
- Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
- Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
- Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
- Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
- Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
- Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
- Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
- Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
- Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
- Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
- Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
- Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
- Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).
