Måling af neuromuskulære Junction funktionalitet
Summary
En funktionel vurdering af den neuromuskulære junction (NMJ) kan give vigtige oplysninger om kommunikation mellem muskel og nerve. Her beskriver vi en protokol for at omfattende evaluere både NMJ og muskel funktionalitet ved hjælp af to forskellige muskel-nerve præparater, dvs soleus-ischiadicus og membran-phrenic.
Abstract
Neuromuskulære junction (NMJ) funktionalitet spiller en central rolle, når man studerer sygdomme, hvor kommunikationen mellem motorneuron og muskel er svækket, såsom aldring og Amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Her beskriver vi en forsøgsplan, der kan bruges til at måle NMJ funktionalitet ved at kombinere to typer af elektrisk stimulation: direkte membran muskelstimulation og stimulering gennem nerve. Sammenligning af muskel svar på disse to forskellige stimulering kan bidrage til at definere, på funktionsniveau, potentielle ændringer i NMJ, der fører til funktionelle nedgang i muskelmasse.
Ex vivo præparater er velegnede til velkontrollerede undersøgelser. Her beskriver vi en intensiv protokol for at måle flere parametre af muskel og NMJ funktionalitet for soleus-ischiadicus nerve forberedelse og membran-phrenic nerve forberedelse. Protokollen varer ca. 60 min. og foregår uafbrudt ved hjælp af en skræddersyet software, der måler spjæt kinetik egenskaber, kraft-frekvens-forholdet for både muskel og nerve stimulering og to parametre specifikt for NMJ funktionalitet, i.e. neurotransmission fiasko og intratetanic træthed. Denne metode blev brugt til at opdage skader i soleus og mellemgulv muskel-nerve præparater ved hjælp af SOD1G93A Transgene mus, en eksperimentel model af ALS, allestedsnærværende overexpresses mutant antioxidant enzymet superoxiddismutase 1 (SOD1).
Introduction
Den neuromuskulære junction (NMJ) er en kemisk synapse dannet af forbindelsen mellem den motor endplate af muskelfiber og motoriske neuron axon terminal. NMJ har vist sig at spille en afgørende rolle, når kommunikationen mellem muskel og nerve er nedsat, som opstår i aldring eller Amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Som muskel og nerve kommunikere i en tovejs måde1,2, kan være i stand til at måle NMJ defekter adskilt fra muskel defekter give ny indsigt i deres physiopathological samspil. Ja, denne funktionelle evaluering kan bidrage til at vurdere, om morfologiske eller biokemiske ændringer reducere neurotransmission signalering funktionalitet.
Sammenligning af muskel kontraktile reaktion fremkaldt af nervestimulation og svar af den samme muskel fremkaldt af direkte stimulering af sin membran er blevet foreslået som en indirekte måling af NMJ funktionalitet. Faktisk, siden membran stimulation af passerer neurotransmission signalering, eventuelle forskelle i de to kontraktile svar kan tilskrives ændringer i NMJ. Denne tilgang har været flittigt foreslået for rotter3,4,5,6,7, og også brugt til at indsamle oplysninger om mus modeller8,9,10,11,12.
Her, beskriver vi i detaljer en procedure for punktafgifter og teste to muskel-nerve præparater, i. e. soleus-ischiadicus og membran-phrenic forberedelserne. Ved hjælp af en skræddersyet software, vi designet en kontinuerlig prøvningsprotokol, der kombinerer måling af flere parametre, der karakteriserer både NMJ og muskel funktioner, derved giver en omfattende vurdering af NMJ skader separat fra de muskel. Navnlig måler protokollen spjæt kraft, muskel kinetik, kraft-frekvens kurve for direkte og nerve stimulering, neurotransmission fiasko13 for både en fyring og de tetanic frekvenser og intratetanic træthed7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forsøgsplan beskrevet ovenfor giver en ideel måde at måle og diskriminere nogen funktionelle ændringer, der er opstået direkte i musklen eller indirekte neuromuskulære junction plan. Da denne teknik er baseret på en indirekte måling af NMJ funktionalitet, kan det bruges til at etablere hvis nogen defekt er relateret til morfologiske ændringer eller biokemiske ændringer. Derimod giver det en effektiv metode til at afgøre, om morfologiske eller biokemiske ændringer har reduceret neurotransmission signalering fu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejde i forfatternes laboratorium blev støttet af Fondazione Roma og Telethon (give nr. GGP14066).
Materials
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Potassium dihydrogen phosphate KH₂PO₄ | AnalaR | 7778-77-0 | |
| Magnesium sulphate MgSO₄ | AnalaR | 7487-88-9 | |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors – 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
Referências
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. . Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
