Måle nevromuskulær Junction funksjonalitet
Summary
En funksjonell vurdering av nevromuskulær krysset (NMJ) kan gi viktig informasjon om kommunikasjonen mellom muskler og nerve. Her beskriver vi en protokoll for grundig vurdere både NMJ og muskel funksjonaliteten med to forskjellige muskel-nerve preparater, i.e. soleus-ischias og membran-phrenic.
Abstract
Nevromuskulær krysset (NMJ) funksjonaliteten spiller en avgjørende rolle når studere sykdommer der kommunikasjonen mellom motor neuron og muskel er svekket, som aldring og amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Her beskriver vi en eksperimentell protokoll som kan brukes til å måle NMJ funksjonalitet ved å kombinere to typer elektrisk stimulering: direkte membran muskelstimulasjon og stimulering gjennom nerve. Sammenligning av muskel respons på disse to forskjellige stimulations kan bidra til å definere, på funksjonell nivå, mulige endringer i NMJ som fører til funksjonelle nedgang i muskel.
Ex vivo forberedelser er velegnet for godt kontrollerte studier. Her beskriver vi en intensiv protokoll for å måle flere parametere av muskel- og NMJ funksjonalitet for soleus-sciatic nerve utarbeidelse og membran-phrenic nerve forberedelse. Protokollen varer ca 60 min og utføres uavbrutt gjennom et skreddersydd programvare som måler egenskapene twitch kinetikk, kraft-frekvens forholdet for både muskel- og stimulations og to parametere gjelder for NMJ funksjonaliteten, i.e. neurotransmission svikt og intratetanic trøtthet. Denne metoden ble brukt til å oppdage skader i soleus og membran muskel-nerve forberedelser ved hjelp SOD1G93A transgene musen, en eksperimentell modell av ALS som overalt overexpresses mutant antioksidant enzymet superoxide dismutase 1 (SOD1).
Introduction
Nevromuskulær krysset (NMJ) er en kjemisk synapse dannet av forbindelsen mellom den motor endplate av muskel fiber og motor neuron axon terminal. NMJ har vist seg å spille en avgjørende rolle når kommunikasjonen mellom muskler og nerve er svekket, som forekommer i aldring eller amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Som muskel- og kommunisere på et toveis måte1,2, kan å kunne måle NMJ feil separat fra muskel defekter gi ny innsikt i deres physiopathological samspill. Faktisk kan denne funksjonelle evalueringen hjelpe for å vurdere om morfologiske eller biokjemiske endringer redusere neurotransmission signalering funksjonalitet.
Sammenligning av muskel kontraktile respons skapte nervestimulering og responsen fra det likt muskelen fremkalt av direkte stimulering av dets membran foreslått som en indirekte måling av NMJ funksjonalitet. Faktisk siden membranen stimulering by-pass neurotransmission signalering, kan eventuelle forskjeller i de to kontraktile svarene tilskrives endringer i NMJ. Denne tilnærmingen har vært mye foreslått for rotter,3,,4,,5,,6,,7, og også brukes til å samle informasjon om musen modeller8,9,10,11,12.
Her beskrive vi i detalj en prosedyre for å avgiftsdirektoratet og teste to muskel-nerve preparater, IE soleus-ischias og membran-phrenic forberedelsene. Ved hjelp av en skreddersydd programvare, vi utviklet en kontinuerlig testing protokoll som kombinerer måling av flere parametere som preger både NMJ og muskel-funksjonalitet, og dermed gir en omfattende vurdering av NMJ skade separat fra det muskler. Spesielt måler protokollen twitch styrken, muskel kinetikk, kraft-frekvens kurve for direkte og nerve stimulations, den neurotransmission feil13 for både en avfyring og tetanic frekvenser og intratetanic trøtthet7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eksperimentell protokollen beskrevet ovenfor gir en ideell måte å måle og diskriminerende alle funksjonelle endringer som har skjedd i muskelen eller indirekte på nevromuskulær krysset nivå. Siden denne teknikken er basert på en indirekte måling av NMJ funksjonalitet, kan det brukes til å opprette hvis noen feil knyttet til morfologiske endringer eller biokjemiske endringer. Derimot, gir den en effektiv måte å avgjøre om noen morfologiske eller biokjemiske endringer har redusert neurotransmission signalering …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeid i forfatternes laboratorium ble støttet av Fondazione Roma og Telethon (gi nei. GGP14066).
Materials
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Potassium dihydrogen phosphate KH₂PO₄ | AnalaR | 7778-77-0 | |
| Magnesium sulphate MgSO₄ | AnalaR | 7487-88-9 | |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors – 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
Referências
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. . Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
